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仔猪应激或饥饿状态下肝脏氨基酸分解产生的碳架进入糖异生途径,生成葡萄糖用于供能,而产生的氨氮进入尿素循环生成尿素。本试验旨在探究过氧化物酶体增殖体激活受体γ辅助激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)通过SIRT3和SIRT5对猪肝细胞尿素循环的调控作用。通过分离与培养猪原代肝细胞,研究胰高血糖素(Glucagon,Glu)对猪肝细胞PGC-1α和尿素循环的影响;建立PGC-1α过表达细胞模型,研究PGC-1α对SIRT3、SIRT5表达,以及鸟氨酸氨甲酰基转移酶(Ornithine carbamoyltransferase,OTC)、氨甲酰磷酸合成酶(Carbamoyl phosphate synthase I,CPS1)活性的作用。主要研究结果如下:(1)胰高血糖素对猪肝细胞PGC-1α和尿素循环的作用。利用两步胶原酶灌注法分离猪原代肝细胞。与无胰高血糖素组相比,胰高血糖素组的精氨酸琥珀酸合成酶(Argininosuccinate synthase,ASS)、精氨酸裂解酶(Argininosuccinatelyase lyase,ASL)和精氨酸酶(Arginase,ARG)mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.01);同时,CPS1和OTC的mRNA升高(P<0.05),但其蛋白水平没有显著(P>0.05)的变化;此外,糖异生作用的催化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(Glucose-6-phosphatase,G6Pase)的mRNA和蛋白水平显著增高(P<0.01),以及显著诱导肝细胞中PGC-1α、SIRT3和SIRT5的表达(P<0.01)。与Ala组相比,Ala+Glu组葡糖糖和尿素浓度都显著增加(P<0.05)。与NH4Cl组相比,NH4Cl+Glu组葡萄糖浓度没有显著变化,但尿素浓度显著升高(P<0.05)。结果表明,胰高血糖素不仅促进丙氨酸碳架走向糖异生,还刺激尿素生成途径关键基因表达,促进丙氨酸氮源进入尿素循环生成尿素。(2)PGC-1α对肝细胞SIRT3、SIRT5表达及OTC、CPS1酶活的作用。PGC-1α表达质粒转染HepG2细胞,利用qPCR和western blot检测PGC-1α的表达,验证了过表达质粒显著提高PGC-1αmRNA水平和蛋白表达量(P<0.01)。与过表达对照组相比,PGC-1α过表达组SIRT3、SIRT5 mRNA和蛋白水平显著增加(P<0.01),但OTC和CPS1 mRNA和蛋白表达没有显著的变化(P>0.05);有趣的是,OTC和CPS1乙酰化水平显著降低,酶活性显著升高(P<0.01)。与Ala组相比,Ala+PGC-1α过表达组显著提高葡萄糖和尿素的浓度(P<0.05)。与NH4Cl组相比,NH4Cl+PGC-1α过表达组对葡萄糖浓度没有显著影响(P>0.05),但尿素浓度显著升高(P<0.05)。以上结果表明:PGC-1α调控丙氨酸碳架走向糖异生同时,通过SIRT3、SIRT5分别去乙酰化OTC和CPS1并激活其活性,诱导丙氨酸氮源进入尿素循环。