研究背景ABO血型系统是人类最先发现的重要血型系统,在输血医学和器官移植等方面具有重要意义。经典的血型血清学方法按照抗原的不同可分为A、B、O、AB四种表型,此外ABO血型系统也存在一定的亚型(弱A或弱B)。上世纪九十年代明确了ABO血型基因的核苷酸序列、结构以及一些常见突变点。ABO基因位于染色体9q341-34.2,包含长度大小从28-688bp不等的7个外显子。现一般将A101作为参考序列,B101有7个核苷酸与A101基因不同,导致蛋白上四个氨基酸变化,其中两处替换(L266M和G268A)决定酶的特性。常见的O等位基因上为第6外显子第261位单核苷酸缺失,造成酶活力的丧失。此外也发现少量的261位未缺失的O等位基因。随着分子技术不断完善,现ABO血型基因分型的方法有PCR-RFLP、PCR-SSP、PCR-SSCP、PCR-SSO、PCR-SBT和PCR-GeneScan等,其中最佳的方法是PCR-SBT。到目前为止,通过分子生物学方法已鉴定200多个ABO等位基因。本研究的目的在于建立ABO血型基因诊断的测序方法(PCRSBT),获取浙江汉族人群ABO血型基因多态性的分布资料,并分析献血人群ABO亚型和不规则抗体分布情况,为临床输血提供更好的技术指导和帮助。实验使用PCR-SBT方法对ABO基因第6、7外显子进行了测序分析,并检测了部分浙江汉族人群标本,发现了三个新的等位基因。实验方法1、标本来源1.1 ABO血型表型分析:2008年7-9月来浙江省血液中心的随机无偿献血者30519名,通过填写征询表确认其民族为汉族。1.2人群中ABO亚型和不规则抗体调查:2008年来浙江省血液中心的随机无偿献血者,共计标本数为167888人次。1.3 ABO血型等位基因分布情况:标本来自2008年7-9月浙江省血液中心的随机无偿献血者。所有标本经其知情同意后采集5ml EDTA抗凝血,分别吸取1-2ml血样贮存在-20℃以下备用。标本总数为417例。2、血清学方法测定2.1 ABO表型检测:采用PK7200全自动血型检测系统测定ABO血清学表型,参照仪器说明书进行操作。2.2 ABO亚型鉴定:对于正反定型不一致或者疑是亚型的标本进行鉴定,采用试管法,具体参照中心参比实验有关操作说明进行。2.3不规则抗体鉴定采用凝集技术在PK7200自动血型检测系统检测。3、标本DNA提取:采用QIAamp Blood Kit商用抽提试剂盒。4、ABO基因第6-7外显子测序分析4.1 PCR扩增:PCR扩增引物序列参照ABO基因序列,采用一对引物对进行5-7外显子扩增,PCR引物序列和扩增条件参照正文,扩增反应体系总体积为25μl。4.2 PCR产物纯化:每孔中加入核酸外切酶Ⅰ1μl(5U),虾碱性磷酸酶2μl(2U),ABI公司的9700型PCR自动扩增仪进行酶切反应,37℃60min,80℃15min。4.3测序反应:分别针对外显子6、7设计四个测序引物,以纯化PCR产物为模板按BigDye Sequencing kit(ABI公司)试剂盒操作进行测序反应,ABI公司9700型PCR自动扩增仪扩增,扩增条件为95℃预变性5min,95℃10s,50℃10s,60℃4min,25个循环,冷却至4℃。4.4测序反应纯化和电泳分析:采用乙醇/醋酸钠法纯化,然后在ABI 3730测序仪上进行测序电泳分析。4.5测序结果分析和判断:SeqScape V2.5软件进行数据分析。5磁珠M-270链亲和素方法分离新等位基因的单倍体当鉴定的新等位基因为杂合子,采用磁珠M-270链亲和素方法(Invitrogen,Wisconsin,USA)分离其单倍体。主要分两步,第一步模板DNA与5′端生物素标记特异性探针反应,生物素探针只与特定的DNA单链结合。第二步将生物素标记单链DNA加入链亲和素化磁珠M-270形成生物素标记DNA-链亲和素包被磁珠,经洗涤、磁选后得到的DNA单链可作为ABO基因外显子6-7的扩增模板。6、统计学分析:人群基因频率(gene frequency,GF)采用直接计数法计算,即检测出的基因个数/2N(N=标本数)。Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验采用x~2检验。p＜0.05表示具有统计学意义。结果1、30519例浙江汉族人群ABO血型表型分布情况采用凝集方法,结果显示A型为9274例,占30.4%。B型为7986例,占26.2%。O型为10542例,占34.5%。AB型为2717例,占8.9%。ABO血型表型分布中O＞A＞B＞AB。2、ABO亚型与不规则抗体检测情况从167888例标本中检出8例ABO亚型,ABO亚型频率为4.8/10万。检出43例不规则抗体,不规则抗体检出频率为2.6/万。其中抗M为32例,占74.4%。抗D为4例,占9.3%。冷凝集为3例,占7.0%。抗H、抗C、抗P1、自身抗体各为1例。抗M为最常见的不规则抗体。3、浙江汉族人群ABO等位基因型分布情况结果显示外显子6、7序列确定的ABO基因型与表型完全相符。在浙江汉族人群中共发现27种基因型,频率大于1%的为11种。常见的基因型分布为A102/O01为54例(12.95%),A102/O02为34例(8.15%),A102/A102为19例(4.56%);B101/O01为56例(13.43%),B101/O02为38例(9.11%),B101/B101为20例(4.80%),O01/O02为70例(16.78%),O01/O01为44例(10.55%),O02/O02为19例(4.56%),A102/B101为33例(7.91%)、人群中基因型为纯合子的为102例(24.46%),杂合子为315例(75.54%)。4、浙江汉族人群ABO等位基因分布情况412例标本中共检测到14个ABO等位基因,包括五个常见的等位基因:A101、A102、B101、O01和O02。此外有6个较少见的等位基因:A205、B110、O04、O05、O07、O50,还有3个新的等位基因:B112、B526C和O743C。频率大于1%的为A101(1.56%)、A102(19.78%)、B101(20.62%)、O01(33.69%)和O02(22.30%)。人群中最常见的等位基因为O01,在A基因中共发现3个等位基因A101、A102、A205,A102频率大于A101,A205发现有2例占0.240%。在B基因中共发现4个等位基因B101,B110、B112、B526C。在O基因中共发现7个等位基因O01、O02、O04、O05、O07、O50、O743C。5、3个新等位基因情况在417例标本中发现3个新的等位基因,三个新等位基因的DNA序列已提交GenBank(序列号为FJ599810、FJ638611和FJ851690)。这三个突变点都发生在外显子7区域。5.1 B112(559T):在一个B/O杂合子个体中发现该等位基因(B112/O01),DNA磁珠纯化技术分离得到单倍体,测序发现在B型单链上存在突变。B112与B101比较在第559位C＞T,导致一个氨基酸改变(Arg187Cys),血清学上未观察到血清学特性的变化。5.2 B526C:在一个AB个体中发现(A102/B526C),通过磁珠纯化获取单链,结果发现B等位基因在526位G＞C,导致一个氨基酸改变。526位是A和B基因间的差异碱基,在该处A型是C、B型是G。该标本未观察到任何血清学特性变化。5.3 0743C:在3个标本中发现存在0743C等位基因,其中两个O型杂合子(O01/0743C)和一个B型杂合子(B101/0743C)。与O01序列比较,0743C发生一个突变743G＞C,由于与O01相同存在261位G缺失,在第261位以后发生阅读框架的移动,形成新的终止密码子,提前终止了转移酶的翻译。结论1、获取了浙江汉族人群ABO血型表型分布情况。2、获取了浙江汉族人群ABO亚型与不规则抗体分布情况。3、首次获取了浙江汉族人群ABO血型等位基因多态性数据。4、发现了三个新的等位基因。