第一部分人血浆GLP-1检测方溘的探索　　 背景：　　 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是人体内最重要的肠促胰岛素之一，它主要由肠道L细胞合成和分泌，自肠道分泌入血后经过肝脏、肾脏并被二肽基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)降解。GLP-1以酰胺化的GLP-1(7-36)以及未酰胺化的GLP-1(7-37)两种活性形式存在[1]。　　 常见的检测GLP-1的方法有ELISA(酶联免疫吸附测试)和RIA(放射性免疫吸附测试)。文献报道ELISA较RIA更适合特异性地检测出GLP-1的活性片段[2].　　 经查找，我们知道的有 USCN life& Technology company的E0804h.GLP-1 ELISA Kit，BioVendor的 Cat.No.:RSCYK160R ELISA Kit和Millipore的 Cat.＃EGLP-35K ELISA Kit。由于只能购买到USCN和Millipore两个试剂盒，因而我们对这两个试剂盒进行了比较。　　 绘制标准曲线时，Millipore优于USCN，故初步选择Millipore的Cat.＃EGLP-35K ELISA Kit，同时对该试剂盒进行了精确性及重复性评价。此外，该试剂盒建议采集标本时加入DPP-Ⅳ抑制剂，然而试剂盒本身不含有DPP-Ⅳ抑制剂。采集血标本时是否必须加入DPP-Ⅳ抑制剂尚有争议。为此，我们进行了DPP-Ⅳ抑制剂的对比试验以观察其对检测结果的影响。　　 目的：　　 本研究在于：1)通过对Millipore的Cat.＃EGLP-35K ELISA Kit标准曲线的绘制，进行精确性、重复性试验来评价该试剂盒的可靠性，为我们后面的研究建立实验方法：2)比较标本中加入DPP-Ⅳ抑制剂与未加入DPP-Ⅳ抑制剂对测定结果的影响。　　 方法：　　 1.以Millipore提供的标准品做复孔，测定荧光定量值，以荧光定量值的平均值为纵坐标，标准品的浓度为横坐标绘制标准曲线。　　 2.精确性试验：取已经测定的浓度不同的2份标本，同一批内各重复测量10次，计算批内变异度。　　 3.重复性试验：取已经测定的浓度不同的2份标本，在5个不同的试剂盒上每份标本重复测量5次，计算批间变异度。　　 4.DPP-Ⅳ抑制剂对比试验：我们对6位志愿者进行口服糖耐量试验，分别抽取空腹、口服75g葡萄糖后30分钟、2小时、3小时、4小时及5小时肘静脉血。采集标本时，一份标本分装成两管，一管加DPP-Ⅳ抑制剂，一管不加，比较两管GLP-1浓度的差异性。　　 结果：　　 1.Millipore试剂盒的标准曲线线性较好，相关系数r＞0.99(p＜0.001)　　 2.精确性试验显示：2份标本的平均GLP-1浓度分别为4.23pmol/L、8.32pmol/L，批内变异分别为6.67％、5.42％，从而可以认为该试剂盒具备较好的精确度。　　 3.重复性试验显示：2份标本的平均GLP-1浓度分别为4.05pmol/L、9.7pmol/L，批间变异分别为10.37％、8.87％，从而可以认为该试剂盒具备较好的重复性。　　 4.DPP-Ⅳ抑制剂对比试验显示：标本中加DPP-Ⅳ抑制剂检测出来的GLP-1水平为(6.15±1.24)pmol/L,未加DPP-Ⅳ抑制剂检测出的GLP-1水平为(5.48±1.02)pmol/L。经配对t检验，差异无统计学意义(P＞0.05)。　　 结论：　　 Millipore提供的检测GLP-1的试剂盒是可靠的，采集标本时不需要添加DPP-Ⅳ抑制剂。　　 第二部分超重肥胖人群5小时口服糖耐量中GLP-1分泌水平的观察　　 背景：　　 超重和肥胖的发病率在我国人群中迅猛增长，并成为一种流行病。据报道，我国成人超重患病或发病率为22.8％，肥胖患病或发病率为7.1％，估计患病人数分别为2.0亿和6000多万[2]。　　 GLP-1是人体内最重要的肠促胰岛素之一，葡萄糖，脂肪，蛋白质以及混合餐负荷后均可以刺激胰岛素分泌[21,22]。　　 GLP-1在肥胖人群中的分泌水平如何呢?国外已经有相关研究，然而报道不一致。众所周知，口服葡萄糖后胰岛素分泌水平明显高于静脉注射等量葡萄糖引起的胰岛素分泌水平，这就是“肠促胰岛素效应”。而且，口服的碳水化合物越多，引起的胰岛素分泌水平越高[23]。有研究显示：口服75g及100g葡萄糖前后，肥胖组GLP-1的水平均低于正常组；而有研究发现口服糖负荷前后肥胖者GLP-1分泌水平均高于正常体重者m。还有研究发现，脂肪餐及标准混合餐负荷前后肥胖人群GLP-1的分泌水平也低于正常人群[16]。　　 肥胖人群GLP-1分泌水平变化的观察多见于国外的研究报道，而且目前仍未有定论，国内未见相关研究；同时，鉴于口服糖耐量试验(OGTT)操作简便，临床上使用普遍，所以我们观察了OGTT中正常体重，超重肥胖人群空腹、负荷后及总反应曲线下面积(TAUC)的GLP-1分泌水平的变化。文献报道中大多数观察了2小时，3小时，极少数4小时。延长糖耐量试验可以更加全面地观察各项指标的动态变化以及观察有无低血糖反应，因此，我们观察了5小时OGTT中GLP-1分泌水平的变化。　　 目的：　　 本研究在于：1)观察正常体重及超重肥胖人群5小时OGTT中GLP-1、血糖、胰岛素、C-肽(C-P)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、HDL-c(高密度脂蛋白胆固醇)及LDL-c(低密度脂蛋白胆固醇)的动态变化；2)分析GLP-1分别与其他各项指标之间的关系。　　 对象与方法：　　 对象：　　 收集积极参与2008年11月到2009年5月在中山大学附属第一医院东山院区举办的“我伴你行”减肥活动的健康志愿者。全部受试者糖耐量正常，依据BMI将受试者分为两组，分别是：正常体重组(BMI：18 kg/m2-24 kg/m2)和超重肥胖组(BMI≥24kg/m2)　　 方法：　　 1)标本采集：全部受试者试验前一天晚上7:00以后禁食，第二天早上7:00抽取空腹以及口服75g葡萄糖后30分钟，2小时，3小时，4小时，5小时肘静脉血，然后立即送往中心实验室4℃，1500g离心10分钟，分离血浆后置于-80℃冰箱保存，3个月内完成检测。所有标本都进行了血糖、血脂、胰岛素、C-肽及GLP-1的测定。　　 2)血糖的测定用葡萄糖氧化酶法，甘油三酯的测定用(甘油磷酸氧化酶-过氧化物酶法)，胆固醇的测定用胆固醇氧化酶法，HDL-c的测定用直接一步法，LDL-c=TC-HDL-c-TG/2.2；胰岛素以及C-肽于东山院区实验室利用RIA法检测。GLP-1的检测使用我们探索到的可靠性较好的Millipore的Cat.＃EGLP-35KELISA Kit.　　 3)统计学方法：采用SPSS13.0进行统计学分析，TAUC利用近似梯形的方法计算，各项检测指标均值用ˉX±S表示。用配对t-Test进行分组因素单独效应分析；用双因素重复测量方差分析进行主效应以及交互效应的分析。用Pearson相关分析进行关联分析，以双侧P＜0.05为有统计学差异的标准。　　 结果：　　 1)参加本次研究的共34人，体重正常组18人，其中男性10人，女性8人，体重为(60.1±8.7)kg，BMI为(22.7±1.3)kg/m2；超重肥胖组16人，其中男性8人，女性8人，体重为(69.3±8.4) kg，BMI为(27.8±3.5)kg/m2；超重肥胖组的体重及BMI明显高于正常体重组(P＜0.001)　　 2)5小时OGTT中，超重肥胖组各时间点的GLP-1水平及其TAUC低于正常组(P＜0.05)　　 3)5小时OGTT中，超重肥胖组空腹、糖负荷后30分钟、2小时、3小时、5小时血糖水平及其TAUC均高于正常组(P＜0.05)　　 4)5小时OGTT中，超重肥胖组空腹、糖负荷后30分钟、2小时胰岛素、C-肽水平及其TAUC均高于正常组(P＜0.05)　　 5)5小时OGTT中，超重肥胖组各时间点的TG水平及其TAUC高于正常组(P＜0.05)　　 6)5小时OGTT中，超重肥胖组与正常组各时间点的TC、HDL-c、LDL-c水平及其TAUC差异无统计学意义(P＞0.05)　　 7)5小时OGTT中，GLP-1与TG水平存在负相关(P＜0.05)；GLP-1与TC，HDL-c、LDL-c的相关性无统计学意义(P＞0.05)；空腹、糖负荷后30分钟、2小时及3小时时的血糖与GLP-1水平的相关性有统计学意义(P＜0.05)；空腹、糖负荷后30分钟、2小时时的胰岛素、C-肽与GLP-1水平的相关性有统计学意义(P＜0.05)　　 结论：　　 1)超重肥胖者GLP-1分泌水平较正常体重者是减弱的。　　 2)GLP-1水平与甘油三酯水平呈负相关。　　 3)血糖、胰岛素及C-肽水平与GLP-1水平存在相关性。