急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是临床上常见的急腹症之一,常常并发肝、肾、肺、肠道等胰外器官损伤。AP肝损伤的机制仍未完全阐明,目前的研究认为与炎性细胞因子、肝细胞凋亡、氧化应激、微循环障碍等多种因素有关,是一个复杂的病理生理过程。P物质(substance P)是神经肽中速激肽家族的重要成员,广泛分布于中枢神经系统及周围神经系统,具有痛觉传导、神经源性炎症、内脏平滑肌收缩及血管扩张等许多生物学活性。P物质在调节炎性细胞的游走中具有重要作用,可引起中性粒细胞的趋化以及白细胞介素8(IL-8)的合成与释放,同时还可引起肥大细胞释放组胺,从而促成炎症反应发生,是神经纤维与炎性细胞间相互作用的介质。P物质与神经激肽受体1(neurokinin receptor, NK-1R)亲合力最强,因而NK-1R又称为P物质受体。NK-1R在神经细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、以及炎性细胞(如淋巴细胞、单核巨噬细胞、中性粒细胞)的细胞膜上表达。P物质与NK-1R结合后,可以抑制胰腺外分泌,减轻各种消化酶对胰腺及胰周组织的损害。但同时还引起血管扩张、白细胞黏附血管壁并游出血管外、血浆外渗等反应。P物质引起的反应实质上是机体对外界有害刺激的防御反应,但过分剧烈则产生不良后果。AP患者肝功能异常率高,肝功能的损害程度与AP病情呈正相关,而一旦发生肝衰竭则预后不良。研究P物质在急性胰腺炎肝损伤时的作用对揭示AP肝损伤机制和提供治疗思路具有一定的意义。目的:研究通过建立大鼠AP模型,并给予NK-1R拮抗剂L-703,606干预,观察肝脏中P物质、NK-1R的表达以及肝细胞凋亡的情况,探讨P物质在AP肝损伤中的作用,探讨NK-1R拮抗剂对AP肝损伤的治疗作用。方法:1动物模型的制备:选取Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,取上腹正中作切口进入腹腔,以4号手术线结扎近肝门端胰胆管,然后用4号加工钝头头皮静脉针于十二指肠乳头附近逆行插入胰胆管,以0.2ml/min速度注入5%牛磺胆酸钠(0.1ml/100g),推药后以左手拇指按紧胰胆管入十二指肠处,观察3min,待胰腺出现明显充血后,剪去结扎线,关腹。2实验分组:将雄性SD大鼠54只,随机分为假手术组(SO group, n=18)、AP模型组(AP group, n=18)、AP+L-703,606组(AP+L-703,606 group, n=18),后以不同时间点3h、6h、12h分为3个亚组。其中AP+L-703,606组于造模前15min腹腔内注射L-703,606(250nmol/kg)。3生化指标测定:取血清样本,采用全自动血清生化分析仪检测血清淀粉酶、脂肪酶、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)由河北医科大学第二医院生化室协助测定。4肝脏和胰腺组织学检查:采用石蜡切片,HE染色。5肝脏P物质和NK-1R的免疫组织化学染色:石蜡切片脱蜡至水,抗原热修复,3%过氧化氢孵育15min,山羊血清封闭30min,滴加一抗4℃过夜。阴性对照用PBS代替一抗。先后滴加二抗、三抗各15min,后用3,3-二氨基苯联胺(DAB)显色,苏木素复染后封片。以细胞浆内呈现黄褐色颗粒为阳性表达。6凋亡测定:采用TUNEL检测试剂盒检测肝细胞的凋亡。结果:1大鼠胰腺的病理学变化:肉眼和光镜所见SO组胰腺及周围组织结构始终大致正常;AP组和AP+L-703,606组,胰腺及周围组织水肿、出血、坏死,且随时间延长损伤程度逐渐加重,腹水和中性粒细胞也逐渐增多;2大鼠肝脏的病理学变化:肉眼和光镜所见SO组肝脏组织结构始终正常;AP组和AP+L-703,606组随时间推移,肝细胞肿胀、变性、坏死和肝索结构解离破坏的范围逐渐增大,程度逐渐加重,炎性细胞浸润也增多。但AP+L-703,606组较AP组肝脏组织的损伤程度较轻。3血清淀粉酶的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组和AP+L-703,606组与SO组比较均显著升高(P<0.01)。AP组和AP+L-703,606组间无差异。4血清脂肪酶的变化:在各时间点,SO组无明显变化,AP组和AP+L-703,606组与SO组比较均显著升高(P<0.05)。AP组和AP+L-703,606组间无差异。5血清谷丙转氨酶的变化:各时间点,SO组无明显变化,AP组和AP+L-703,606组与SO组比较均显著升高(P<0.05)。AP组和AP+L-703,606组间无差异,但AP+L-703,606组各时间点均低于AP组。6肝脏P物质变达的变化:SO组,有散在分布的P物质表达于肝细胞胞浆内,成棕黄色颗粒。AP组和AP+L-703,606组,均有较强的表达。免疫组化评分显示AP+L-703,606组表达强度低于AP组。7肝脏NK-1R表达的变化:SO组,NK-1R表达于肝细胞胞浆,染色为棕黄色颗粒。AP组和AP+L-703,606组表达均强于SO组。免疫组化评分显示AP+L-703,606组表达较AP组弱。8肝细胞凋亡的变化:SO组几乎没有阳性细胞表达,AP组和AP+L-703,606组均可见细胞核呈棕黄色染色的阳性细胞,且随时间延长数量增加。但AP+L-703,606组数量少于AP组。结论:1逆行胆胰管内注射5%牛磺胆酸钠,血清淀粉酶、脂肪酶升高,胰腺组织HE染色观察到胰腺及周围组织水肿、出血和坏死等表现,证实大鼠AP模型制备成功。2 AP组和AP+L-703,606组大鼠血清ALT均明显升高,HE染色观察到肝脏组织结构破坏,肝细胞变性、坏死,TUNEL检测到明显的肝细胞凋亡,说明AP时大鼠肝脏出现损伤。3 AP大鼠肝脏组织中P物质及其受体NK-1R表达增加,表明P物质与AP肝损伤有密切联系。4 L-703,606是NK-1R的特异性拮抗剂,它通过阻断P物质与NK-1R结合抑制P物质发挥生物学效应。给予L-703,606后P物质和NK-1R表达降低,血清ALT降低,肝细胞凋亡减少,肝脏组织损伤减轻。因此认为,AP时P物质通过与NK-1R结合参与了肝损伤,是AP肝损伤的重要原因之一。