肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）目前是发展中国家发病率最高的肿瘤，在全球的肿瘤相关死因中位居第三。目前，肝癌的发病率在我国呈逐步上升趋势，其死亡率在我国恶性肿瘤死亡比例也名列前茅。肝细胞癌的发生与肝炎病毒感染、肝纤维化等慢性肝脏疾病紧密相关。由于现有诊断治疗技术的限制，大多数肝癌患者确诊时已经处于中晚期，其预后大多不良，这也给相关治疗带来更多的困难。如果能够早期诊断，及时治疗，例如外科手术、肝移植、介入栓塞、射频等综合性治疗方法，则能取得相对较好的治疗效果。目前在临床上最常使用的肝癌血清标记物是AFP，但AFP对诊断HCC有20%-30%的假阳性率，临床上仍有一些AFP阴性的HCC患者漏诊，因此，AFP阴性的HCC患者的生物标记分子是目前研究的焦点。近年来，稳定同位素标记质谱定量检测等高通量的蛋白质组学实验技术为蛋白质组的功能研究提供了一个崭新的技术平台。通过前期iTRAQ技术的筛查，本课题组已经筛选和鉴定出了一批肝癌血清差异表达蛋白。由于人类肿瘤基因的不稳定性、异质性等复杂因素的影响，在这些差异表达蛋白中，既含有肿瘤形成所必需的关键性改变,也含有仅仅因肿瘤基因组的不稳定性而产生的伴随性改变。因此，如何将那些影响肿瘤发生发展的关键性分子改变从伴随性改变中识别出来，是肿瘤标志物研究领域的重要挑战之一。为解决这个问题，本课题组采用如下策略：（1）在与正常对照血清比较的差异表达蛋白中，分析比较肝癌/肝炎，肝癌/肝纤维化差异表达蛋白，得到两组均存在的共同差异表达蛋白；（2）利用STRING软件，构建差异蛋白相互作用网络，获得处于蛋白相互作用网络的关键节点蛋白；将共同差异表达蛋白与关键节点蛋白做相关分析，除AFP外，得到7个可能影响肝癌肿瘤发生发展的候选蛋白，分别是：Heparin cofactor2（HCII），Angiotensinogen（AGT），Hemopexin（HPX），Complement C4-B（C4B），Insulin-like growth factor-binding protein3（IGFBP3），Fibronectin（FN1），Gelsolin（GSN）。基于质谱的目标蛋白定量技术是标志物从发现通向临床验证的桥梁，就蛋白定量而言，质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术作为一种一次性可以同时检测多个候选蛋白质、高特异性、高灵敏度的质谱数据获取方式，逐步受到更多的研究者们关注。在进行MRM分析时，现代质谱仪可通过MRM扫描模式对大批量的样本监测，查看是否有此排列的母-子离子对出现。如若信号出现，证明此分子在样本中存在，仪器将自动切换至MS/MS扫描模式，确定此母离子的碎片离子信息，并再次鉴定并确认该分子的结构。由于MRM扫描模式高效快速，且具有极高灵敏度，因此非常适合于高通量验证与确认生物标志物。此外MRM技术高通量的特点，也为多种蛋白质的同时定量提供了条件。前期试验，课题组利用iTRAQ技术对肝癌血清差异表达蛋白进行了鉴定与验证，得到了七个目标蛋白的表达图谱，本研究通过利用更为灵敏的MRM质谱检测技术，对上述7个候选蛋白中的两个蛋白进行检测验证，重点比较健康对照与AFP阴性HCC（AFP<25ng/ml）患者血清中血色素结合蛋白（Hemopexin，HPX）和肝素辅因子Ⅱ（Heparin cofactor2，HCII）两个差异表达蛋白，验证AFP阴性HCC患者血清中HPX和HCII蛋白表达水平与前期iTRAQ-MALDI-TOF/TOF筛选结果的一致性，为AFP阴性HCC的新的潜在标志物研究提供新的参考依据。第一章利用MRM技术建立质谱相对定量分析方法目的利用MRM（multiple reaction monitoring，MRM）技术，建立不依赖抗体的质谱定量检测方法。方法通过skyline软件选择标准品β半乳糖苷酶（Beta-Galactosidase,BG）定量的肽段及母-子离子对并优化；通过5次重复实验计算方法的相对标准偏差RSD%（Relative Standard Deviation, RSD）；将BG加入到酵母提取物酶切产物中，模拟血清中复杂蛋白背景环境，建立复杂背景下标准曲线。结果在多次实验中反复被鉴定的可用于蛋白定量分析的BG三个唯一肽段分别为：VDEDQPFPAVPK，IDPNAWVER，GDFQFNISR；5次重复实验MRM检测BG积分峰面积的RSD%均小于6%；三个肽段在0.625～50×10-6fmol/L的浓度范围内线性相关良好，标准曲线R2值为0.99852～0.99955，三个肽段在浓度为0.625×10-6fmol/L时依然可以检测到稳定的质谱峰，显示了方法的高灵敏度。结论建立了MRM质谱相对定量检测的方法，为MRM质谱定量检测血清标志物奠定了基础。第二章利用MRM技术相对定量分析肝癌血清标志物HPX和HCII目的利用已经建立的MRM技术检测肝癌患者血清中HPX和HCII两个蛋白在肝癌患者血清中表达水平,验证iTRAQ实验结果的可靠性。方法1.采集10例AFP阴性HCC血清，匹配10例正常对照人群血清。血清样本去除高丰度蛋白后酶解，iTRAQ标记（肝癌标记116，正常对照标记113），SCX分镏和反向C18柱洗脱点靶，进行5800-MALDI-TOF/TOF质谱检测。2.未经抗肿瘤治疗AFP阴性的HCC患者5例，1:2匹配性别、年龄健康的对照者血清10例。严格按照MRM质谱检测操作要求，通过skyline软件选择HPX和HCII两个蛋白定量肽段的母-子离子对，并优化CE，利用MRM技术检测样本中HPX和HCII两个蛋白的表达水平。结果1.iTRAQ结合LC-MALDI-TOF/TOF质谱筛选和鉴定HPX在AFP阴性HCC患者血清中表达水平，116:113=3.5645，P＞0.05；HCII在AFP阴性HCC患者血清中表达降低，116:113=0.7178，P=0.0179。2.MRM技术在血清中反复被鉴定的可用于蛋白定量分析的HPX蛋白的唯一肽段为：EWFWDLATGTMK、GGYTLVSGYPK、NFPSPVDAAFR；HCII蛋白三个唯一肽段分别为：QFPILLDFK、TLEAQLTPR、YEITTIHNLFR。3.通过加入BG标准品校准系统误差，对AFP阴性HCC患者与正常人血清中鉴定肽段之间积分峰面积比值进行统计，结果显示：，HPX在正常人与AFP阴性HCC患者血清中积分峰面积比值分别为431.58±116.74,347.62±84.89，P＞0.05；HCII在正常人与AFP阴性HCC患者血清中积分峰面积比值分别为26.604±11.645,16.032±4.381，P＜0.05，HCII在AFP阴性HCC患者血清中表达下降。4.MRM相对定量检测HPX和HCII的结果与iTRAQ筛选结果一致。结论1. MRM技术可以一次性同时检测血清中多个蛋白标志物；2.经MRM结果证实，HCII在AFP阴性的HCC患者血清中表达降低，可能是AFP阴性的HCC患者血清标志物。3. MRM质谱检测方法具有操作简便，灵敏度高、准确度高、重现性好而且同时对多个候选蛋白进行检测的独特优势，是肝癌血清标志物定性和定量的可靠验证方法。