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哺乳动物的早期胚胎发育的分子调控是生命科学研究的重要课题之一,是精细而又复杂的有序调控过程,包括受精卵的分裂、紧密态、桑葚胚和囊胚的形成。植入前胚胎的正常发育对胚胎着床及产生健康子代的十分重要,在此期间胚胎受到众多蛋白因子的调控,任何基因表达异常都有可能导致受精卵发育障碍。虽然已有很多文献报道哺乳动物的植入前胚胎发育的相关研究,但是对于其潜在的分子机制仍不十分清楚。因此,研究可能影响胚胎发育的因素,对于揭示哺乳动物生殖规律、改善胚胎质量以及预防出生缺陷提供新的理论基础和临床依据。Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2),是细胞内一种重要的转录因子,众所周知的是调节着体细胞及肿瘤细胞内众多抗氧化反应,可增强细胞对氧化应激和亲电子化学物质的抗性。生理条件下,含有Cul3泛素连接酶活性的Keapl可以降解Nrf2蛋白,Keapl-Nrf2体系使可诱导的抗氧化防护和细胞的生物能学协调的结合起来。中药鸦胆子是一种常用的抗肿瘤中草药,鸦胆子苦醇(Brusatol)是来源于鸦胆子的主要成分,是一种Nrf2的天然抑制剂。本实验选用昆明小鼠植入前胚胎为实验材料,利用Brusatol抑制Nrf2蛋白表达,验证Nrf2在小鼠植入前胚胎发育中的表达,探究不同浓度的Brusatol对植入前胚胎发育潜能的影响,评估Nrf2对维持胚胎质量过程中贡献。本课题研究用不同浓度Brusatol处理小鼠植入前胚胎的合子期细胞,观察细胞在不同浓度下的发育率并筛出最佳浓度;应用免疫荧光检测Nrf2蛋白在小鼠植入前胚胎发育的不同时期即2-细胞、4-细胞、桑葚胚和囊胚的表达和定位;通过实时荧光定量PCR方法检测细胞周期相关基因及其激酶在2-细胞期胚胎的mRNA水平表达的变化并通过EdU检测细胞周期;Western blot验证Brusatol对Nrf2蛋白表达的影响;再通过合子期添加Brusatol的同时过表达Nrf2激活质粒证明Nrf2确实在其中发挥作用;最后通过γ-H2AX抗体染色分析细胞中DNA损伤程度。研究结果表明Brusatol确实可以下调Nrf2蛋白的表达。免疫荧光分析发现从2-细胞期到囊胚期Nrf2主要定位在细胞质并且富集在细胞核。不同浓度的Brusatol处理后细胞发育率随浓度升高成负相关,用200 nM Brusatol处理后几乎没有细胞发育到4细胞期,并且大部分细胞停滞在2-细胞期。我们进一步用RT-PCR检测发现和对照组相比,Brusatol抑制剂组的Cyclin B及其激酶CDK1和Cyclin E及其激酶CDK2以及其下游Rb的mRNA水平均降低。γ-H2AX染色后荧光显微镜分析发现细胞核并未被着色说明Brusatol处理细胞可能不是通过DNA损伤来发挥作用。显微注射后同时添加Brusatol后观察细胞发育的潜能与只添加Brusatol组相比显示恢复了部分发育潜能。因此我们得出结论,在小鼠早期胚胎发育中Brusatol确实可以抑制Nrf2蛋白表达,并且结果表明抑制Nrf2表达可影响有丝分裂细胞周期,这可能是体外胚胎发育障碍的主要原因之一。Brusatol可能主要通过下调Nrf2,进而影响Cyclin B-CDK1促进细胞周期由G2向M期转变,进而影响小鼠早期胚胎发育。