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香菇是著名的食药兼用菌,在我国食用真菌产业中占有重要地位,但近年来香菇病毒病造成了香菇产量和质量下降,严重威胁着香菇产业的持续正常发展。目前有关香菇病毒的报道主要是病毒的形态学研究,病毒分子生物学研究,尤其是病毒基因组序列分析和快速高效的病毒分子检测方法研究尚处在初级阶段。本文研究结果将促进香菇病毒多态性、病毒复制调控机制及病毒与宿主细胞相互作用等方面的研究,并为香菇病毒病的早期检测和病毒病早期防治提供科学依据。
本研究从染病子实体中分离得到20-50nm球形香菇浙江病毒(Lentinula edodes mycovirus-CZ,LeV-CZ),基因组为15kb左右dsRNA。实验得到的10346 bp序列有两个ORF,ORF1编码218kDa的推测蛋白,ORF2编码159kDa的RdRp。香菇病毒ORF1序列中含多个UAAUG终止/重启动基元,可能与病毒的形态多样性相关。系统进化研究发现,LeV-CZ与大伏革菌病毒RNA1(PgV-dsRNA1)亲缘关系最近,作者认为LeV-CZ可能是单组分RNA病毒科的独特成员。在对LeV-CZ基因组ORF1生物信息学分析基础上,成功表达44kDa和50kDa两个截短蛋白。将原核表达的蛋白经镍柱纯化后免疫小鼠,通过SDS-PAGE发现,LeV-CZ结构蛋白的分子量为55kDa、33kDa和27kDa。使用原核表达蛋白抗体不能检测病毒结构蛋白,预示病毒可能存在亚基因组。部分病毒基因组sg-DIG标记探针的制备,为今后进行病毒亚基因组的研究奠定了基础。
根据香菇杆形病毒基因组部分序列设计特异性引物,建立了RT-PCR检测方法,对36个浙江香菇栽培菌种进行鉴定,其中7个样品不含香菇病毒,是无病毒香菇菌种;样品“灵”中可能含有香菇杆形病毒或其它病毒,需要进一步鉴定;其余的28个样品可能被病毒污染或脱毒不完全,不宜继续使用。