年龄相关性白内障(age related cataract, ARC)是全球首位致盲性眼病。目前手术仍是治疗白内障唯一有效的方法,因此预防或药物干预措施的相关研究,具有重要意义。外消旋化是一种常见的蛋白质翻译后修饰(post-translationalmodification,PTM)类型。研究表明,随年龄增长,晶状体蛋白中的部分L型氨基酸残基(主要是天冬氨酸/天冬酰胺)倾向于通过外消旋化反应转化为D型,导致晶状体蛋白构象改变,聚合形成高相对分子质量的蛋白质并在核区和皮质逐渐积累,晶状体蛋白失去原有功能而不能维持晶状体透明度。外消旋化在晶状体蛋白年龄相关性改变中的效应和参与程度,及其对白内障发生与进展的具体机制都值得进一步研究。本研究将围绕晶状体内最重要的结构蛋白——a晶状体蛋白,发生含量最高的PTM类型——外消旋化后,产生的对晶状体的效应展开,主要包括晶状体细胞膜流动性和晶状体蛋白者两方面的改变。我们借助白内障患者晶状体和晶状体上皮细胞加热模型来分别研究自然衰老和模拟衰老情况下,a晶状体蛋白外消旋化对晶状体细胞膜和蛋白分子伴侶功能的相关效应,以此全面评价a晶状体蛋白外消旋化对年龄相关性白内障发病的影响,为将来的预防和非手术干预提供更好的切入点。第一部分检测α晶状体蛋白外消旋化程度目的：优化反相高效液相色谱(reversed phase high performance liquid chromatography RP-HPLC)的实验洗脱方案,检测人晶状体组织及晶状体细胞加热模型中α晶状体蛋白的外消旋化程度。方法：(1)自然衰老：使用凝胶过滤HPLC从人透明晶状体和白内障晶状体核区中分离得到α晶状体蛋白后,经O-苯二醛(o-phtalaldehyde, OPA)和N-叔丁氧羰基-L-半胱氨酸(N-tertbutyloxycarbonyl-L-cysteine, Boc-L-Cys)柱前衍生和RP-HPLC C18柱分离得到各样本对应的D型和L型氨基酸出峰图,计算D/L比值,得出α晶状体蛋白的外消旋化程度。白内障晶状体以LOCSⅢ系统为标准进行分级,细分为ARC NC2-3和ARC NC5-6组。(2)模拟衰老模型：初步构建了晶状体细胞加热模型来模拟衰老条件,即在50℃条件下分别培养晶状体上皮细胞Omin、30min和60min后,同样进行α晶状体蛋白的分离纯化、酸水解、柱前衍生、上样及外消旋化程度的测定。结果：使用改进的RP-HPLC洗脱方案能够更好地对D/L型氨基酸进行分离。我们发现,(1)在自然衰老条件下,正常对照组的α晶状体蛋白外消旋化程度最低,平均14.55%±0.16%,ARC NC2-3级组次之,平均15.3%±0.28%,ARCNC5-6级组最高,平均15.52%±0.19%。其中ARC两组的α晶状体蛋白外消旋化程度显著高于对照组(P<0.05)。此外,随着ARC患者的晶状体核分级和年龄的升高,其核区α晶状体蛋白外消旋化程度呈逐渐增加的趋势。(2)在模拟衰老条件下,随着晶状体细胞加热时间的延长,α晶状体蛋白外消旋化程度逐渐升高。结论：无论是在自然还是模拟衰老条件下,α晶状体蛋白外消旋化程度均呈现增加趋势。第二部分α晶状体蛋白外消旋化对晶状体细胞膜流动性及分子伴侣功能的影响目的：在模拟衰老条件下,比较α晶状体蛋白外消旋化对晶状体细胞膜流动性及分子伴侣功能的影响。方法：使用Laurdan染色和双光子共聚焦显微镜检测各组晶状体细胞(lens epithelial cells,LECs)膜流动性的改变。使用免疫荧光染色检测各组晶状体细胞中aA晶状体蛋白(CRYAA)的表达及分布。以α晶状体蛋白和靶蛋白(p和γ晶状体蛋白)光散射(相对混浊度)差值的百分比计算相对保护度,即以α晶体蛋白抑制β和Y晶体蛋白的热凝聚的作用表示分子伴侣活性,以检测α晶状体蛋白外消旋化对其他晶状体蛋白分子伴侣功能的影响。结果：随着加热时间的延长,hLECs中外消旋化的CRYAA逐渐向核周富集,晶状体细胞膜流动性是逐渐增加的。正常人和ARC晶状体核区提取得到的α晶状体蛋白可以保护加热诱导β和γ晶状体蛋白的热凝聚。同样地,未加热和加热晶状体细胞中提取得到的α晶状体蛋白可以保护加热诱导p和丫晶状体蛋白的热凝聚。但ARC晶状体核区及加热晶状体细胞中提取得到的a晶状体蛋白对β、γ晶状体蛋白的相对保护率低于正常晶状体核区及为加热晶状体细胞中的α晶状体蛋白。结论：α晶状体蛋白中Asx残基外消旋化程度的升高,可能导致晶状体细胞膜流动性增加及分子伴侣功能的下降。第三部分干预α晶状体蛋白外消旋化对晶状体细胞膜流动性及分子伴侣功能的影响目的：通过干预α晶状体蛋白外消旋化,从细胞学角度验证α晶状体蛋白外消旋化对晶状体细胞膜流动性及分子伴侣功能的影响。方法：首先筛选了针对性的siRNA (small interfering RNA),转入晶状体上皮细胞系后,经验证可以特异性抑制PCMT1基因转录和翻译,干预PIMT的表达,得以完善在细胞层面上的研究。然后进行蛋白提取、Western Blot测定转染效率,并用反相HPLC分析各组α晶状体蛋白的Asx残基外消旋化程度,再比较处理后的各组α晶状体蛋白对β、γ晶状体蛋白分子伴侣功能的差异。结果：使用siRNA干扰序列转染细胞并达到PIMT酶抑制效果后,晶状体上皮细胞中α晶状体蛋白外消旋化程度升高,不仅对细胞膜流动性的调节效应有一定影响,同时也在一定程度上削弱了α晶状体蛋白对其他晶状体蛋白的分子伴侣功能。结论：从细胞学上验证了α晶状体蛋白外消旋化对细胞膜流动性及对其他晶状体蛋白的分子伴侣功能存在一定调节作用,可能是晶状体衰老的重要机制之一。