论文部分内容阅读
研究背景：2013年末Science评出年度十大科学进展,肿瘤免疫疗法夺魁[l],肿瘤免疫细胞治疗技术已逐渐成为继手术、放疗、化疗之后的第四类治疗手段而日益受到重视。2011年Weinberg等在Cell发表了重要综述,总结癌症的十大特征,免疫逃逸被概括为其典型生物学特性。同年,诺贝尔医学奖授予Ralph Steinma等三位免疫学家,自此,抗肿瘤监视逃脱机制和抗肿瘤免疫治疗取得了日新月异的突破。曹雪涛院士在Nature Immunology综述了肿瘤发生过程中的免疫正性调节和负性调节“阴阳失衡”观点,分析了免疫抑制细胞增多是自身免疫系统抗肿瘤失败的关键因素(见右图)。髓系来源免疫抑制细胞(Myeloid derived suppressor cell, MDSC)最早发现于肿瘤浸润淋巴细胞中,随着研究深入,MDSC被发现在肿瘤患者的外周血、肿瘤局部、引流淋巴结、脾脏、骨髓等免疫器官均有分布,且与不良预后相关。其免疫抑制功能是通过iNOS和精氨酸酶Arginase-1及下游效应分子NO或ROS,扩增免疫抑制性的CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞、削弱效应性T细胞激活,在更高层面上进行免疫负性调节。MDSC还与免疫抑制性的M2肿瘤浸润巨噬细胞(TAM)通过TGFβ和IL-10进行交互作用,增强抑制性的免疫微环境。又有文献表明,肿瘤通过外泌体(exosomes)调节IL6-STAT3通路和TLR2通路,也能激活MDSC扩增、增强免疫抑制,促进肿瘤生长。因此,肿瘤-MDSC-Treg调控轴在肿瘤发生发展中的作用日益受到重视。肿瘤化疗是目前最有效的全身治疗手段,强烈化疗虽能通过急性炎症、凋亡诱导等途径,促进肿瘤相关抗原释放而增强肿瘤免疫原性、提升机体抗肿瘤免疫,但其免疫负性调节作用也很明显——Nature Medicine报道,吉西他滨和5-FU等药物,能上调MDSC细胞来增强肿瘤免疫抑制性而削弱疗效。目前一类靶向清除免疫抑制细胞的单抗药物已获得成功,比如特异性抑制负调控分子CTLA-4(伊匹单抗,Ipilimumab)和PD-1/PD-L1(BMS-936558)的新药,已经在恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌中取得明显疗效。这说明靶向清除免疫抑制性细胞(Treg、 MDSC细胞等),解除肿瘤免疫耐受状态,调动人体自身免疫杀伤功能,能够取得较好的治疗效果。Galectin-3(半乳糖凝集素-3)发现于上世纪90年代,属凝集素家族,广泛表达于上皮细胞和免疫细胞,参与多种生物学功能,如生长、粘附、凋亡等。近年文献报道,在多种肿瘤中Gal-3表达均升高,进一步上调Arginase-1等抑制性基因,调控肿瘤浸润巨噬细胞(TAM)向免疫抑制性的M2细胞分化,能削弱抗肿瘤免疫,促进肿瘤生长。本课题组长期从事肿瘤微环境免疫调节机制研究,项目负责人于2007-2009年在美国贝勒医学院细胞与基因治疗研究中心进修,跟随Wang Rongfu教授的Peng Weiyi小组学习,该小组发现Gal-3作为结肠癌肿瘤抗原,可激活肿瘤反应性T细胞,但在高浓度时却诱导T细胞凋亡。有研究表明此种诱导凋亡的机制,在于外源性Gal-3结合T细胞表面CD29/CD7复合物,激活凋亡通路。研究目的：本项目主要目标在于阐明Gal-3分子的天然配体LCP通过拮抗Gal-3信号通路,下调荷瘤小鼠体内MDSC细胞的数目、解除其免疫抑制效应、协同化疗增效的确切分子机制。随着本项目在肿瘤免疫学基础研究、转化研究的突破,对未来进行临床试验验证LCP逆转肿瘤免疫抑制,并联合T细胞过继免疫治疗及传统放化疗的综合治疗模式也是有益提示,故本项目不仅有理论价值,在临床应用方面具有广阔前景。研究内容：1、明确抗肿瘤化疗模型中LCP处理与MDSC水平的确切关系：绘制肿瘤生长曲线分析LCP对化疗增敏作用；提取LCP处理小鼠的血清,经HPLC-MS法分析小鼠血清中LCP的有效含量,及LCP有效成分的低分子糖蛋白序列、结构；流式细胞术(FCM)分析MDSC细胞的在不同处理组中的比例差异。2、Gal-3信号通路阻断对MDSC细胞功能的调节作用：RNA水平及蛋白水平分析4T1肿瘤细胞和小鼠MDSC细胞Gal-3基因表达水平；使用Gal-3抗体或化学合成Gal-3,正向、负向调节Gal-3信号通路,明确Gal-3在血浆中的免疫调节作用;以及Gal-3在MDSC细胞中的存活、增殖、分化等多个环节中的调节作用。3、Gal-3对MDSC分化、成熟、行使功能过程中基因表达的调控：使用Gal-3基因敲除小鼠,分析Gal-3下游信号通路的相关靶分子,如K-ras、PI3K等,在MDSC免疫调节作用中,RNA水平和蛋白质水平的变化。结论与创新：1、利用4T1细胞系建立了Balb/c小鼠的乳腺癌自发肿瘤模型,并利用该模型阐明低分子柑橘果胶联合化疗可抑制乳腺癌的肿瘤生长,延长乳腺癌荷瘤小鼠的生存时间。2、低分子柑橘果胶协同化疗增敏的机制,不是通过增强细胞毒性,而是削弱了免疫抑制性的MDSC细胞所产生的免疫微环境。3、进一步信号通路分析显示,低分子柑橘果胶是通过阻断Galectin-3分子,来减少MDSC在小鼠体体内的积累。4、本项目拟后续进一步对LCP-Gal-3信号通路在MDSC细胞中的作用进行深入研究,探索Gal-3与MDSC介导的肿瘤免疫抑制作用之间的关系。