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目的雄激素受体(androgen receptor,AR)在人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2,HER2)阳性(HER2-positive,HER2+)的乳腺癌中高表达,60%左右的HER2阳性乳腺癌表达AR,并且预后较差。ErbB3结合蛋白1(ErbB3 binding protein 1,EBP1)是调控细胞周期的一个关键因子,可以促进细胞分化。有文献报道,在前列腺癌中,EBP1可以直接调控AR相关的基因,但是二者在HER2阳性的乳腺癌中的具体机制仍不清楚。本研究目的是分析EBP1-AR通路在HER2阳性乳腺癌中的作用以及相关作用机制。方法1.首先随机抽取HER2阳性浸润性乳腺癌石蜡组织样本140例以及HER2阴性浸润性乳腺癌石蜡组织样本142例,免疫组织化学染色(immunohistochemistry staining)检测AR、EBP1的表达水平和细胞内定位,应用统计软件SPSS24.0,分析两者分别在HER2阳性和HER2阴性浸润性乳腺癌中的表达差异以及与临床病理特征的关系、相关性及预后意义。2.然后随机选取3例配对的HER2阳性的新鲜癌组织与癌旁组织,提取组织蛋白,用Western blot检测EBP1的蛋白表达水平,随机抽取8例配对的HER2阳性的新鲜癌组织与癌旁组织,提取组织RNA,用实时定量PCR(RT-qPCR)方法检测EBP1的核酸表达水平。3.在HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3,MDA-MB-453以及HCC1954中,用Western blot检测EBP1的基础表达,免疫荧光检测AR、EBP1定位,然后分别构建EBP1过表达和降表达的质粒,在HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3,MDA-MB-453中分别转染EBP1过表达和降表达质粒,RT-qPCR和Western blot检测EBP1和AR信号分子核酸和蛋白表达,划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell检测细胞侵袭能力,CCK8和平板克隆检测细胞增殖能力。4.免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)验证EBP1蛋白分子复合物的形成,双荧光素酶报告基因检测EBP1对AR的调控作用。5.构建AR过表达以及降表达质粒,探究AR在HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3发挥的作用。另外为进一步验证EBP1在AR与HER2之间的作用,在HER2阳性乳腺癌细胞系SK-BR-3中,一组转染AR降表达质粒,另一组同时转染AR降表达质粒和EBP1过表达质粒,Western blot检测EBP1、AR、HER2的蛋白表达,RT-qPCR检测HER2的核酸表达,CCK8、平板克隆检测细胞增殖能力,Transwell检测细胞侵袭能力,划痕实验检测细胞迁移能力。6.在HER2阳性乳腺癌细胞系HCC1954中验证AR在EBP1与HER2之间发生的作用。一组转染EBP1上调质粒,一组同时转染EBP1上调质粒和AR上调质粒,另一组同时转染EBP1上调质粒和AR下调质粒,用RT-qPCR检测HER2的核酸表达情况。7.在双免疫缺陷小鼠体内分别种植稳定转染下调EBP1的质粒、转染下调AR/上调EBP1的质粒以及相应空载质粒的HER2阳性乳腺癌细胞SK-BR-3,每组5只裸鼠,培养48天后取出肿瘤组织,观察移植瘤发生率、瘤块大小和肝肺转移灶,并对瘤块进行HE染色和免疫组化(immunohistochemistry,IHC)染色,对肝肺转移灶进行HE染色观察是否有癌细胞转移。结果1.在HER2阳性以及HER2阴性浸润性乳腺癌石蜡组织样本中,EBP1呈胞浆表达,AR呈胞核表达,其中在HER2阳性的浸润性乳腺癌石蜡组织样本中,EBP1高表达率为47.9%(67/140),EBP1低表达率为52.1%(73/140);EBP1的表达与组织学分级高低之间具有统计学意义(P<0.001),也与AR的阳性阴性表达以及淋巴结的有无转移情况之间具有统计学意义(P值分别为<0.001,0.013)。在HER2阴性的浸润性乳腺癌石蜡组织样本中,EBP1高表达率为62.0%(88/142),EBP1低表达率为38.0%(54/142);EBP1的表达与组织学分级高低、AR的阳性阴性表达以及淋巴结的有无转移情况之间没有统计学意义,但是与孕激素受体(progesterone receptor,PR)的表达有关(P=0.002)。在HER2阳性的乳腺癌病例中,AR的阳性率是60%(84/140),AR阴性率是40%(56/140),AR的表达与组织学分级高低,淋巴结有无转移情况以及EBP1的高低表达之间具有统计学意义(P值分别为0.001,0.042,<0.001)。AR的表达与EBP1的表达之间呈现负相关关系(r=-0.802,P<0.001)。并且在HER2阳性的乳腺癌中,EBP1高表达比低/不表达的患者具有更好的预后,AR阳性表达比阴性表达的患者具有更差的预后。AR阳性EBP1低/不表达的乳腺癌患者的无病生存与总生存低于其他组(AR阳性EBP1高表达组,AR阴性EBP1低/不表达组,AR阴性EBP1高表达组)。AR和EBP1的共表达是影响无病生存(P=0.015)和总生存(P=0.002)的独立预后因素。2.在3例随机抽取的配对的HER2阳性的新鲜癌组织与癌旁组织中,Western blot结果显示EBP1在乳腺癌组织中低表达,在配对的癌旁组织中高表达。在8例随机抽取的配对的HER2阳性的新鲜乳腺癌组织与配对的癌旁组织中,RT-qPCR结果也显示EBP1在癌组织中低表达,在癌旁组织中高表达。3.WB结果显示,SK-BR-3,HCC1954,MDA-MB-453乳腺癌细胞系的表型为HER2阳性,AR阳性,EBP1低表达。免疫荧光结果显示AR呈核表达定位,EBP1呈浆表达定位。然后在EBP1表达较低的SK-BR-3以及MDA-MB-453乳腺癌细胞系中感染EBP1质粒慢病毒来上调EBP1的表达,感染EBP1质粒空载模板慢病毒作为对照组。Western blot结果显示与转染空载质粒组相比,过表达EBP1组中AR和HER2蛋白水平表达下降,RT-qPCR结果显示与转染空载质粒组相比,过表达EBP1组中AR和HER2的核酸表达水平下降。划痕实验结果显示,EBP1过表达能够抑制HER2阳性乳腺癌细胞的迁移能力,Transwell细胞侵袭实验显示EBP1过表达能够抑制HER2阳性乳腺癌细胞的侵袭能力,CCK8和平板克隆结果分别显示EBP1过表达能够抑制HER2阳性乳腺癌细胞的增殖能力。降表达EBP1质粒组与转染空载质粒组相比,Western blot结果显示AR和HER2的蛋白表达水平增加,RT-qPCR结果显示AR和HER2的核酸表达水平增加。划痕实验,Transwell细胞侵袭实验,CCK8和平板克隆结果分别显示,EBP1降表达能够促进HER2阳性乳腺癌细胞的迁移,侵袭,增殖能力。4.co-IP实验结果表明AR和EBP1蛋白两者之间能形成蛋白复合物。双荧光素酶报告实验结果显示,在293-T细胞系中,一组同时转入AR全长启动子质粒和EBP1过表达质粒,另一组同时转入AR全长启动子突变的质粒和EBP1过表达质粒,还有一组转入空载的质粒作为对照。测量出三组萤火虫荧光素酶反应强度与内参海肾荧光素酶反应强度的比值(ratio),三组中的比值具有统计学差异。5.分别用AR上调以及AR下调质粒慢病毒稳定转染SK-BR-3乳腺癌细胞系,Western blot显示HER2在蛋白水平上随AR的过表达而增加,随AR的降表达而降低,EBP1的表达没有明显的变化。RT-qPCR结果显示HER2在核酸水平上随AR的过表达而增加,随AR的降表达而降低,EBP1的表达没有明显的变化。然后用AR下调同时EBP1上调质粒慢病毒稳定转染SK-BR-3乳腺癌细胞系,Western blot与RT-qPCR结果显示与AR下调相比,AR下调的同时EBP1上调时,HER2表达水平进一步降低。划痕实验,Transwell细胞侵袭实验,CCK8和平板克隆结果分别显示,与单独AR下调组相比,AR下调同时EBP1上调组中细胞的迁移,侵袭,增殖能力进一步降低。6.RT-qPCR结果显示,在乳腺癌细胞系HCC1954中,与单独EBP1上调组,AR上调同时EBP1上调组相比,EBP1上调同时AR下调组中,HER2的核酸表达水平最低。说明AR在EBP1调控HER2的过程中是起作用的。7.将三种不同处理组(EBP1下调组、AR下调/EBP1上调组和转入空载质粒的对照组)的乳腺癌细胞系SK-BR-3注射到免疫缺陷的小鼠中,每两天测量三组中肿瘤的大小以及生长情况。培养48天后,切除肿瘤组织,观察移植肿瘤的发生率,肿瘤大小以及肝和肺转移情况。肿瘤组织用HE和免疫组织化学染色。肝和肺组织用HE染色,观察是否发生转移。EBP1下调组的裸鼠肿瘤体积最大,AR下调/EBP1上调组的裸鼠肿瘤体积最小,肿瘤组织的Ki67免疫组化结果显示,AR下调/EBP1上调组中的Ki67表达是最低的,EBP1下调组中的Ki67表达是最高的,并且在该组中出现了肺转移,其他组中未见肺转移。该实验结果表明下调EBP1的表达能够促进肿瘤的生长,增殖和转移能力,上调EBP1同时下调AR的表达能够抑制肿瘤的生长,增殖和转移能力。结论EBP1和AR在HER2阳性乳腺癌组织中的表达呈现负相关关系,EBP1和AR的共表达是无病生存与总生存的独立预后因素。在HER2阳性乳腺癌细胞系中,EBP1的表达影响了AR,HER2的表达,上调下调EBP1能够影响HER2阳性乳腺癌细胞系的迁移、侵袭、增殖能力。同时AR在EBP1对HER2的调控中发挥着重要的作用。这些发现将为EBP1治疗HER2+AR+乳腺癌提供了实验数据和理论依据。