目的:口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)简称口腔鳞癌,多发生于40～60岁成人,男性多于女性,好发部位以舌、颊、牙龈、腭等为主的上皮源性恶性肿瘤。近年来报道,OSCC是口腔颌面部最常见肿瘤,其发病率约占口腔肿瘤的90%,其死亡率约占世界癌症死亡率的第六位。在临床上,OSCC侵犯到患者面部血管、神经等部位时会出现颌面部剧烈疼痛或麻木等症状。严重时甚至会威胁生命,极大地影响患者生活质量。OSCC发病隐匿、病情进展快、恶性程度高、易复发等特点,且大部分患者确诊时已属中、晚期。而且OSCC容易发生淋巴结转移、局部侵袭性很强,因此预后一般都较差。在治疗方面,以手术为主的综合治疗依然是目前最有效的治疗手段。随着相关研究的不断进展,OSCC患者治愈率有所改善,但患者预后仍然较差,给临床治疗带来了很大困难。因此如何实现早期预防、早期诊断、探索OSCC的敏感诊断标记物以及有效治疗的个体化治疗方案,提高临床治愈率及生存率是目前备受关注的问题之一。微小RNA(microRNA,mi RNA)是一种小的非编码的RNA,通过作用于靶基因的mRNA 3′非编码区(3′untranslated region,3′UTR)使得靶基因mRNA表达沉默,在转录后水平上参与基因的表达调控,从而影响mRNA稳定性或干扰蛋白质翻译,进而发挥癌基因或者抑癌基因的作用。大量研究表明miRNA参与肿瘤的演变并发挥着重要的作用,作为抑癌基因或原癌基因参与了肿瘤的发生发展。本研究首先利用TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas,TCGA),结合临床病理资料的生存分析及分层分析,筛选与HNSCC和OSCC生物学行为及预后相关的差异性miRNA;综合生物信息学预测分析和其他研究成果,我们锁定has-microRNA-99a-5p可能作为抑癌基因,分子生物信息学分析其可能通过特异性靶点抑制,在OSCC肿瘤细胞的增殖和侵袭中发挥作用。近年来,有关miRNA-99a-5p可作为抑癌基因抑制多种肿瘤细胞的增殖和侵袭的研究已有一些报道,作为一类新发现的miRNA,其调控机制尚不完全清楚,尤其在OSCC的发病机制中研究尚少。因此,本实验拟对miRNA-99a-5p在OSCC中的表达及相关功能进行研究,并进一步探索其作用的相关分子调控机制,旨在为OSCC寻找敏感的诊断标记物及特异性干预治疗靶点,提高临床诊断治疗水平。研究方法:1、数据收集,通过数据库网站下载HNSCC患者相关临床病例资料(https://portal.gdc.cancer.gov/)。利用编程软件R语言对下载数据资料进行系统整理和统计学分析。通过Active Perl、R和RStudio软件进行miRNA表达谱分析,经过单因素、多因素Cox回归分析筛选差异表达miRNA。2、利用Kaplan-Meier和ROC曲线分析(ROC curve analysis)方法进行生存分析,并建立判断预后的风险模型;同时利用DAVID在线工具对选定的差异表达miRNA进行生物信息学功能注释与通路分析预测;miRanda、TargetScan7.1、picTar网络数据库软件进行靶基因靶点的分析和分子通路预测。3、实时定量荧光PCR技术检测口腔鳞癌组织和体外细胞miR-99a-5p基因的表达。利用CCK-8方法、划痕及Transwell实验,来观察miR-99a-5p在OSCC细胞增殖、迁移和侵袭过程中的作用。4、结合数据库和网站预测miR-99a-5p可能与FGFR3存在靶向结合位点,进一步通过双荧光素酶报告证实FGFR3与miR-99a-5p之间的靶向关系。利用real time PCR和western blot检测FGFR3在正常口腔角质细胞系和不同的口腔鳞癌细胞系中在mRNA和蛋白表达水平的差异。利用CCK-8、划痕及Transwell实验检测FGFR3的敲低对口腔鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,进一步证明miR-99a-5p能够介导FGFR3对OSCC的生物学性能产生影响。5、统计学分析:实验结果及数据分析利用版本SPSS 22.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)软件进行统计分析,P<0.05表示组间比较统计学上有差异。结果:1、基于TCGA数据库分析结果,我们发现三个特异性差异表达miRNA(hsamiR-99a(P=0.0078)、hsa-miR-499a(P=0.0023)、hsa-miR-1911(P=0.0304)),它们为HNSCC患者生存显著相关的独立风险因素。2、miRNA signature risk score的生存分析结果显示hsa-miR-499a和hsa-miR-1911系数为正,表明其高表达与短生存及不良预后相关;而hsa-mi R-99a系数为负,表明其高表达与长生存及好的预后相关。作为保护因素的hsa-miR-99a在低风险组中的表达高,而作为危险因素的hsa-miR-499a和hsa-miR-1911在高风险组中表达高。3、KEGG和GO分析提示HNSCC可能与多个分子信号通路相关。其中JAKSTAT信号通路、酪氨酸代谢等代谢途径及激素相关蛋白基因的变化可能与HNSCC的密切相关。4、miR-99a-5p在OSCC组织中为低表达,与癌旁正常组织相比,其相对表达量下调0.46倍(**P<0.01)。5、miR-99a-5p在四种OSCC细胞系CAL-27、Tca8113、HSC-3、SCC-4中的表达水平显著低于正常人口腔角质细胞株HOK细胞。其相对表达量分别是人正常口腔角质细胞系HOK的0.48倍、0.30倍、0.16倍和0.19倍,显著下调(**P<0.01)。6、miR-99a-5p mimics过载后能够明显降低OSCC的侵袭和迁移功能(*P<0.05),对细胞增殖的无明显影响(P>0.05)。7、生物信息学预测结果提示:FGFR3基因的3′UTR区与miR-99a-5p存在靶向结合位点,FGFR3可能是miR-99a-5p直接作用的重要靶分子。8、FGFR mRNA和FGFR3蛋白表达量在OSCC细胞系CAL-27和Tca8113中明显高于正常人口腔角质细胞。9、Pearson correlation相关分析显示FGFR3的表达水平与miR-99a-5p的表达水平呈负相关,miR-99a-5p mimics过载后能够明显下调FGFR3。10、双荧光素酶实验进一步证实miR-99a-5p与下游FGFR3存在靶基因结合位点。11、miR-99a-5p能够负向调控FGFR3,靶向敲减FGFR3后,OSCC的增殖、转移和侵袭功能均下降。上述结果提示miR-99a-5p通过靶向FGFR3调控口腔鳞状细胞癌增殖、侵袭及转移功能这一分子学机制。结论:1、基于TCGA数据库生物信息学分析及实验结果,我们发现miR-99a-5p作为OSCC特异性表达miRNA之一,在肿瘤中低表达,是生存相关的独立风险因素;miR-99a-5p具有降低OSCC细胞的侵袭和迁移功能,提示具有潜在的抑制侵袭转移能力。2、双荧光素酶实验证实miR-99a-5p与下游FGFR3存在靶基因结合位点;miR-99a-5p mimics过载后能够明显下调FGFR3;miR-99a-5p能够负向调控FGFR3,靶向敲减FGFR3后,OSCC的增殖、转移和侵袭功能均下降。综上结果提示microRNA-99a-5p通过靶向FGFR3调控口腔鳞状细胞癌增殖、侵袭及转移这一分子机制。