背景资料 皮肤的烧伤，创伤，慢性溃疡，肿瘤切除等多种因素都可以造成皮肤的全层损伤。如何修复创面，促进创面愈合，及改善愈后的功能和外观是外科领域的基本问题。皮肤组织工程的兴起为创面治疗揭开了崭新的一页。1975年Reinwald和Green在体外成功地培养了人皮肤角朊细胞膜片；1981年，O’Connour首次成功地将培养的自体表皮膜片(cultured epithelial autograft,CEA)应用于治疗烧伤创面。虽然CEA的使用拯救了许多生命，但它提供的只是表皮部分，移植存活率不稳定，愈后功能和外观得不到改善。真皮成份在促进创面愈合及改善愈后上起着重要的作用。经过多年的努力，在真皮替代物上的研究已取得了很大的成绩。目前，真皮替代物主要有三种类型：1．脱细胞异体真皮。2．合成的生物可降解材料。3．由交联的动物胶原基质构成。国外的人工皮肤产品，价格均十分昂贵，一块7.5cm直径的Apligraf为975$，50cm~2的Epicel 790$(即CEA)，120cm~2Integra 1000$，而国内在研制胶原多孔膜加其它生物相容性材料再种植入真皮成纤维细胞构成活性人工真皮的研究还很少见，更没有形成商品。胶原和壳聚糖制取比较容易，所需成本不高，两者混合有一定机械强度，可用于构建人工皮肤。我们研究浙大自行研制的胶原壳聚糖多孔膜的细胞毒性并在多孔膜种植人皮肤成纤维细胞，初步形成了活性人工真皮替代物。完全意义上的组织工程化皮肤应当包括表皮和真皮，创面最终的愈合仍然要靠表皮覆盖。为此，我们进行了皮肤角朊细胞的培养，并在胶原壳聚糖平面膜上种植人皮肤角朊细胞构成了以可降解人工膜为载体的人表皮膜片作为表皮替代物，结合活性人工真皮替代 浙江大学硕士学位论文物，有望应用于创面修复。这在自主开发人工皮肤的研究上有很大的意义。目的 初步构建胶原－壳聚糖人工皮肤替代物，并从构建材料的细胞毒性和耐酶消化能力，人工真皮替代物上成纤维细胞的增殖和活性情况及冻存的可能性等多方面进行研究，为将其进一步应用于创面修复作准备。材料和方法 胶原－壳聚糖多孔及平面膜由浙江大学高分子材料和工程学系提供。一．皮肤细胞培养1．人真皮成纤维细胞厂bS）的培养 取包皮环切术获得的皮肤以组织块培养法得到人真皮成纤维细胞并传代培养，以5叫 代细胞为工作细胞。2．胎儿皮肤角阮细胞的培养（KC） 取胎龄5个月后的引产胎儿背部皮肤，以酶消化法得到角肮细胞，培养角肮细胞并传代培养。二．胶原－壳聚糖多孔膜浸出液细胞毒性的研究 将胶原壳聚糖多孔膜浸提液用于培养FbS，空白对照为含10％小牛血清的 DMEM培养液。培养 1、3、5天时以 MTT法测定光吸收值（OD），按下列公式计算相对增殖率 （Ralativ growth rate，RGR）。RGR＝（实验组光吸收值／对照组光吸收值）X 100％然后按 ISO／TC194文件评定细胞毒性。三．胶原－壳聚糖人工真皮替代物的构建 干热交联的胶原－壳聚糖多孔膜置 96 yL板，按 10～。m‘种植 Fbs，D地M作培养基（高糖，含10％新生牛血清及双抗100u加厂置37t，5％CO。孵箱内培养，每 2～3天换液一次。种植后 6天，17天作石腊切片，观察 FbS在膜上形成的组织学结构。四．吸光值（OD）与细胞数的关系 调整 Fbs密度至 ZX 10‘／ml，在 96孔板上按梯度稀释至 SX 10’／孔，2．5X10’／了L，1．25X10’／了L，6．25X10‘子L，3．13X10‘／yL，1．56X10’／于L，7．8 2 浙江大学硕士学位论文X 10’／孔，作 3 复孔。MTT法测定光吸收值（OD）。记录结果，并用 Excel软件处理，得到细胞数与OD的回归方程。五．人工真皮替代物上FbS增殖及活性情况5．IFbS的增殖情况 将 Fbs种植在多孔膜，密度约在 3 X 10丫cm’，以 96孔培养板为对照。每 3天换液。种植当天及 1、3、5、7、17天分别测定 OD值。利用四．所述回归方程可得到细胞数，细胞数取对数值，将上述种植于多孔膜及培养孔中的细胞增殖情况以半对数图表示进行比较。5．ZL－2磷酸维生素C增加人工真皮替代物细胞活力情况 按 6．l方法种植 FbS并加人 L－2磷酸维生素 C，终浓度 50 P M。种植后1、3、5、7、17天测定 OD值。与 FbS种植在多孔膜（不加 L－2磷酸维生素C）比较。5．3人工真皮替代物 Fb S分泌细胞因子情况 种植细胞3天时换液，再培养1 天，取上清，用抗体夹心ELISA法测定人工真皮上清液几 －6，IL－8，以 DMEM＋10％小牛血清作对照进行比较。六．冻存人工真皮替代物的初步试验 FbS种植于 96孔板上的多孔膜后 5天，将其加入含 DMEM培养液 ＋ 20％新生牛血清＋ 10％DMSOI．sml的冻存管中，置石棉泡沫盒后，移人一80C冰箱中。分别于3大，14天时取出20管，37C水浴复温。于复苏后1、3、5、12天，用 MTT法测定 OD值。七．干热交联多孔膜与未交联的多孔膜体外降解情况