【摘 要】
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为了探讨cyclinE,cdk2在乳腺癌细胞周期进程中的作用,利用DNA重组技术构建了cyclinE以及cdk2的反义RNA真核表达载体.通过磷酸钙共沉淀法,将重组质粒转入人乳腺癌细胞系Bcap_3
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为了探讨cyclinE,cdk2在乳腺癌细胞周期进程中的作用,利用DNA重组技术构建了cyclinE以及cdk2的反义RNA真核表达载体.通过磷酸钙共沉淀法,将重组质粒转入人乳腺癌细胞系Bcap_37(简称B37),经G418筛选得到各质粒转染的阳性克隆分别命名为NLE,NLK2.利用neo基因特异的引物,这PCR检测确定在NLE,NLK2中均含有重组质粒,而且Western blot结果也表明在NLE中的cyclinE,在NLK2中的CDK2表达水平明显下降.建立起细胞模型后,为了探讨cyclinE和CDK2的作用,对有关细胞的特性进行了分析,与对照组细胞相比,转入重组质粒的细胞的增殖速率明显下降,细胞培养6天时,生长抑制率在64.3-64.7%之间,细胞周期时相分析表明G1期细胞所占比例增加7-8个百分点,S期细胞所占比例下降了9-12个百分点,在软琼脂中集落的形成率下降50-60%而且集落明显变小.细胞在裸鼠中的肿瘤形成能力明显下降.利用Northern blot方法,分析了每种转染细胞中P21,cyclinB,cyclinA,CDC2的基因表达.NLE和NLK2中cyclinA,cyclinB,cdc2的表达均有所下降,P21的表达则上升.Western blot结果与Northern blot基本一致,NLE和NLK2中cyclinA,cyclinB,cdc2的表达均有所下降,P21的表达则上升;此外,还发现NLE和NLK2中cyclinD1,CDK4的表达与对照相比没有变化.
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