肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是临床常见的恶性肿瘤之一,位列全球范围肿瘤相关性死因第二位。HCC患者预后较差原因主要在于患者临床诊断时病期已较晚,肿瘤出现肝内或远处器官转移。索拉非尼是目前唯一批准用于HCC治疗的多靶点药物,HCC患者出现索拉菲尼抵抗也是影响其生存期的主要问题。既往研究发现,外泌体作为多种不同类型细胞分泌的纳米囊泡,可通过转运多种生物活性分子至靶细胞,参与肿瘤微环境的调控,进而影响肿瘤进展、转移及药物抵抗等。此外,肿瘤细胞来源的外泌体携带其来源细胞特异性的蛋白、脂类和miRNA等,因而将外泌体作为多种肿瘤诊断的生物标志物越来越受到人们重视。然而,目前关于不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体在HCC索拉菲尼抵抗以及EMT引起的肿瘤转移方面的作用尚未见报道。此外,外泌体关键miRNA在HCC诊断以及肿瘤发展中的具体作用和机制报道较少。本研究以HCC细胞来源的外泌体为研究重点,探讨不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体在HCC索拉菲尼抵抗、侵袭转移和临床诊断中的潜在作用和具体分子机制。我们首先通过超速离心方法提取了不同侵袭特性HCC细胞培养上清内的外泌体,并应用TEM、western blot等方法进行分析、鉴定。然后将受体HCC细胞与索拉菲尼及不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体共培养,探讨HCC细胞来源的外泌体与肿瘤细胞索拉菲尼抵抗的关系。我们发现不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体可在体内和体外诱导HCC细胞索拉菲尼抵抗,且高侵袭HCC细胞来源的外泌体效果更强。HCC细胞来源的外泌体可能通过逆转索拉菲尼引起的细胞凋亡以及激活HGF/c-Met/Akt通路,上调多种药物抵抗相关蛋白发挥此作用。然后,我们研究了不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体在肿瘤细胞侵袭、转移中的作用和机制。我们通过细胞划痕、Transwell等实验研究不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体对受体细胞迁移、侵袭能力以及细胞表型蛋白的影响。并进一步通过应用外源性TGF-β及其抑制剂LY2109761处理细胞后提取的外泌体验证以上作用。我们研究发现,高侵袭特性的HCC细胞来源的外泌体可通过递送其内的转化生长因子(TGF-β)至受体HCC细胞影响其生长微环境,驱动其细胞表型变化,进而影响肿瘤细胞的进展和转移。最后,我们探讨HCC细胞来源的外泌体内其它关键分子如miRNA等在HCC进展、临床诊断和预后判断中的作用。我们应用miRNA芯片方法筛选不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体内显著差异表达的miRNA,根据设定的Cut-off值筛选出miR-665作为候选miRNA,其在HCC中未见报道。研究发现HCC患者血清外泌体miR-665水平较正常对照组明显升高,且与HCC患者肿瘤大小、浸润转移、临床分期以及患者预后等临床病理指标密切相关。进一步体内、外实验研究提示,HCC细胞来源的外泌体可能通过miR-665激活MAPK/ERK通路促进肿瘤细胞的增殖,应用慢病毒转染特异性敲低HCC细胞来源的外泌体miR-665后,效果较前明显减弱。研究提示外泌体内miR-665或可作为HCC诊断及预后判断的有效标志物。此外,我们还对HCC细胞来源的外泌体携带的蛋白进行分析,发现其含有与肿瘤细胞恶性增殖、血管新生密切相关的VEGFR等。综上所述,我们的研究系统探讨了不同侵袭特性HCC细胞来源的外泌体在HCC索拉菲尼抵抗、侵袭转移以及临床诊断、预后判断中的作用和机制。我们发现,HCC细胞来源的外泌体可能通过转运其内的多种生物分子(细胞因子、蛋白、miRNA等)影响受体细胞增殖、转移和药物抵抗等。且HCC细胞来源的外泌体根据其来源细胞侵袭特性不同,其内成分存在表达差异。我们的研究揭示了 HCC来源的外泌体在肿瘤药物抵抗和侵袭转移中的作用和分子机制,对于开发针对外泌体及其内生物分子的新型HCC诊疗手段提供帮助和理论支持。