前言 慢性肾功能衰竭(Chronic Renal Failure，CRF)患者体内的氧化应激反应是增强的。血液透析(Hemodialysis，HD)治疗可以激活体内的补体系统，刺激中性粒细胞以及单核细胞的氧代谢，产生大量的活性氧族(Reactive Oxygen Species，ROS)，使得CRF患者体内的氧化应激反应进一步增强。与此同时HD治疗还导致一些抗氧化物质的损失，如维生素C、E、谷胱甘肽等，导致HD患者体内ROS的产生和抗氧化系统之间失平衡。维持性血液透析(Maintenance Hemodialysis，MHD)患者在接受HD治疗，尤其是使用生物相容性差的透析膜时，血-膜接触使得ROS的产生增多。ROS主要与DNA中的核糖反应，夺取其C-4位上的H原子，导致DNA结构不稳定，发生断裂。目前检测DNA链的断裂的主要方法是单细胞凝胶电泳实验，即彗星实验(Comet实验)。本实验将通过Comet实验来了解MHD患者淋巴细胞的DNA损伤程度，同时观察不同种类的透析膜及维生素C对MHD患者DNA的氧化损伤程度是否有影响。 实验材料与方法 一、实验材料 淋巴细胞分离液、1％普通熔点琼脂糖、1％低熔点琼脂糖；恒温水浴箱、离心机、培养箱、电泳仪、荧光显微镜。 二、实验方法 1、研究对象：选择我院血液净化中心接受MHD治疗6个月以上、临床情况稳定、年龄大于20岁的CRF患者20例，随机分成2组，每组10例。1组为HE组，使用血仿膜透析12周；2组为PS组，使用聚砜膜透析12周。同时选择7例在年龄、性别与患者组相匹配的健康人作为正常对照组。 2、检测方法： ①、分离淋巴细胞：取抗凝全血50ul置于锥底离心管中，1ml室温1640稀释，加入淋巴细胞分层液，4℃，4500r／分钟离心3分钟后获得淋巴细胞。 ②、孵育:将获得的淋巴细胞悬液分为2组，1组加人1血1640;1组加人1耐10u岁血维生素C，37℃，孵育1小时。 ③、COMET实验:将细胞悬液离心后加人低融点琼脂糖制备成细胞悬液备检。载玻片上分别均匀的铺一层普通熔点琼脂糖、细胞悬液、低融点琼脂糖。待琼脂糖凝固后，将载玻片浸人4℃裂解液中裂解、解旋、电泳、中和、染色后，于荧光显微镜下观察结果，并摄影、记数彗星率及彗星尾部长度。 ④、结果观察:每个观察对象同时做2张片子，每张片子记数50个细胞，测量彗星整体长度及头部直径，计算后得出彗星尾部长度，作为DNA氧化损伤程度的观察指标。 三、统计分析:实验数据采用SPSS n .5统计软件进行描述性及相关分析，组间比较采用单因素方差分析，维生素C处理前后使用独立样本t检验，数据以又土S表示，以P<0 .05为有统计学意义。结果 1、各组彗星尾长的测量值:MHD患者的彗星尾长和彗星率均显著高于正常对照组(HE组彗星尾长:0.970士0.120um，彗星率14.8%;PS组彗星尾长0.656土0.187um，彗星率11.5%;对照组彗星尾长0.286士0.194um，彗星率5.3%;P<0.05)。维生素C处理前HE组彗星尾长及彗星率均显著地高于PS组(P<0.05)。维生素C处理后HE组彗星尾长为0.788土0.26Otnn，彗星率为13.5%;PS组彗星尾长为0.670*0.295uln，彗星率为11.6%。两组维生素C处理前后彗星尾长和彗星率没有显著统计学差异。 2、DNA氧化损伤与血清肌醉、尿素氮的相关性:DNA损伤程度与患者的血清肌醉、尿素氮浓度呈显著的正相关(P宾0.001)。 3、DNA氧化损伤与其他因素的相关性:未发现年龄及透析龄与DNA的氧化损伤之间存在显著相关性。讨论 MHD患者体内氧化应激反应增强可能与以下三个因素作用有关:尿毒症本身状态、透析膜的生物相容性和透析液的病原微生物污染。尿毒症患者DNA氧化损伤增强是肾功能衰竭、毒素蓄积的结果。而患者接受血液透析治疗时，血一膜的接触，在患者体内ROS的产生中起着重要的作用。当使用生物相容性差的透析膜(如纤维素膜)进行透析治疗时，ROS的产生将会增多。ROS主要与DNA中的核糖反应，除去C一4位上的H原子，导致DNA结构不稳定，发生断裂。此外，血液透析所使用的透析液内通常不同程度的存在内毒素含量，它可刺激巨噬细胞、中性粒细胞的氧代谢，产生ROS。Comet实验作为研究DNA双链结构改变的实验方法，因其灵敏性和可靠性得到了广泛的应用。本实验即是使用此方法来检测MHD患者淋巴细胞的DNA损伤情况。 ”本实验结果发现，MHD患者的DNA损伤程度显著地高于正常对照组，。NA损伤程度与患者的血清肌配、尿素氮浓度呈显著的正相关，这说明MHD患者DNA氧化损伤增强是肾功能衰竭、毒素蓄积的结果。但未能发现年龄及透析龄与DNA的氧化损伤之间存在显著相关性，这可能与本实验的样本量较小，受试对象的平均年龄及透析龄相对较短有关。本实验结果还发现使用血仿膜透析的患者的淋巴细胞的DNA损伤程度重于使用聚矾膜透析的患者，由此可见透析膜生物相容性的优劣对DNA氧化损伤的影响是不可忽视的。 本实验同时观察了维生素C对DNA氧化损伤的修复作用，从而研究其抗氧化的机制。我们的结果未能发现维生素C对MHD患者淋巴细胞的DNA损伤有显著的改善作用。但是在HE组，我们发现使用维生素C处理