杨树是世界上许多国家普遍种植的树种,也是我国经济林、防护林和绿化林的主要树种。近年来,由于大面积种植和树种单一等原因,以杨扇舟蛾(Clostera anachoreta Denis et Schiffermiiller,1775)和分月扇舟蛾(Clostera anastomosis Linnaeus,1758)为主的食叶害虫的危害连年发生。杨扇舟蛾颗粒体病毒(Clostera anachoreta D. granulovirus, ClanGV)和分月扇舟蛾颗粒体病毒(Clostera anastomosis L. granulovirus, CaLGV)分别是杨扇舟蛾和分月扇舟蛾的病毒性病原。前期感染性实验证明,二者可能具有较近的亲缘关系。病毒杀虫剂具有不杀伤天敌、对人畜安全、不污染环境、可在自然界传播等优点。但是,杀虫速度慢、寄主过于单一的特点却限制了它的大规模推广。为了在基因组水平上对病毒进行改造,需要深入了解病毒的遗传背景、侵染与复制机制、基因的结构和功能。基于这些原因,本课题对ClanGV和CaLGV的全基因组进行了测定、分析和比较,对ClanGV的结构蛋白质组进行了解析和研究。(一)杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV)的全基因组测序与分析虫体克隆法分离了单一基因型ClanGV,生物测定结果说明该病毒对杨扇舟蛾具有较高的致死作用。测定了ClanGV的全基因组,其大小为101,487 bp, C+G含量为44.4%。它预计编码123个开放阅读框(ORF),这些编码序列占了全基因组序列的93%。在此123个ORF中,119个在已经报道的杆状病毒基因中有同源子,2个ORF仅仅在已测序的NPV中存在,2个ORF是ClanGV的Unique ORF。杆状病毒研究通常设定两个ORF之间的基因重叠必须不大于25个氨基酸,但是发现全长只有210bp的Clan118(lef10)与Clan119(vp1054)有104bp的基因重叠,与文献报道一致。在ClanGV和12个已经测序的GV之间,有82-103个同源ORF。ClanGV和其它GV之间同源ORF的平均同源性为55.5%到43.1%。"Gene parity plot"分析结果表明,ClanGV基因组与CpGV、 AdorGV、CrleGV、PiraGV、PhopGV和ChocGV的基因组显示了很好的共线性；与其它GV相比较,ClanGV的ORF20-ORF39区域是反向的。ClanGV基因组中具有p6.9的同源ORF(Clan71),Clan71与其他GV的同源性为43%(HearGV)至72%(PiraGV).与ChocGV一样,ClanGV缺少XecnGV ORF26的同源子。在ClanGV中,发现了17个杆状病毒结构蛋白的同源ORF、2个抗细胞凋亡基因(P35 and IAP),还有16个DNA复制与转录相关的基因(ie-1、dnapol、helicase、lef-1、lef-2、lef-3、lef-4、lef-5、lef-6、lef-8、lef-9、lef-10、 lef-11、39k、p47和vlf-1)。ClanGV的基因组在富含AT的基因间区域含有4个hr,它们缺少回文序列核心,仅含有若干直接重复。在ClanGV中,64个ORF拥有TATA box; Ie-1是一个已知的极早期基因,然而ClanGV的ie-1没有检测到已知的启动子序列；68个ORF拥有晚期启动子,其中的42个同时具有早期启动子；22个ClanGV的ORF拥有enhancer-like序列单元。基于杆状病毒29个核心序列的进化分析表明,ClanGV和hopGV、AdorGV、CpGV、CrleGV、PiraGV、ChocGV具有更近的亲缘关系。(二)CaLGV和ClanGV的比较基因组学研究CaLGV基因组包含101,818bp, G+C含量为46.7%。它的基因组大小和G+C含量与ClanGV的(101,487bp和44.4%)非常接近。CaLGV基因组的整个核苷酸序列与ClanGV具有90%的同源性。在CaLGV基因组中共鉴定了123个ORF,编码序列占了全基因组序列的93.4%。与ClanGV一样,CaL118 (lef-10)和CaL119 (vp1054)之间的重叠为104bp,但是这两个基因在其它病毒中已经得到验证。在123个ORF中,64个与颗粒体蛋白基因相同,59个与颗粒体蛋白方向相反。CaLGV的123个ORF并不和ClanGV的123个ORF一一同源。有119个CaLGV的ORF在ClanGV中具有同源子,它们的转录方向和组织方式相同。在这119个同源ORF中,75个具有不低于90%的同源性,31个具有80～89%的同源性,两对最低的同源性为53%(CaL18和Clan18)和56%(CaL35和Clan34).在许多杆状病毒中都存在的bro基因,CaLGV和ClanGV中均没有发现。相对于ClanGV,在CaLGV中共发现7834处核苷酸替换(6048处转换和1786处颠换)和1857处插入/缺失。CaLGV和ClanGV蛋白编码区的平均核苷酸置换率是8.33%。从CaLGV基因组的26,309bp到34,650bp之间的区域,是最大的序列差异区,仅仅有84%的核苷酸序列同源性。ClanGV的全基因组包括4个hr,然而CaLGV仅仅具有1个hr。这个hr与ClanGV的hr4处于完全相同的位置。ClanGV的hr包括3个直向重复,然而CaLGV的hr仅仅有2个直向重复,二者都缺少回文序列序列。CaLGV包含4个Unique基因,ClanGV有2个Unique基因。有8对基因仅仅在CaLGV和ClanGV中存在,而在其它的杆状病毒中没有同源子。CaLGV的基因组含有33个重叠区域,包括8对3’端相对基因、12对5’端相对基因和13对转录方向相同基因。ClanGV具有36个基因重叠区域,其基因重叠特征与CalGV的明显不同。有9个ClanGV的基因重叠在CaLGV中并不存在。CaLGV和ClanGV的基因间序列分别占全基因组的6.6%和7%。在CaLGV的90个基因间序列中,有35个与ClanGV的不同。系统发育分析表明,CaLGV和ClanGV被分派到了GV中的同一个亚分枝上。目前,仅仅有3个GV含有P35(ChocGV, CaLGV和ClanGV)。CaLGV和ClanGV的P35具有86%的氨基酸同源性。"DQMDG"结构域是P35被caspase切割的位点,但是在CaLGV和ClanGV P35的相应位置却是84TVCDG88。(三)杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV) ODV的蛋白质组学研究分别从具有包涵体的病毒和去除包涵体的ODV病毒粒子中分离总蛋白。利用LC-MS/MS共鉴定出74种蛋白质,是目前用质谱技术鉴定出最多ODV蛋白的杆状病毒。在这些蛋白中,70种鉴定出了2个或多于2个的肽段,只有4种蛋白(Clan45、Clan79、ALK-EXO和FGF-3)被鉴定出一个肽段。本研究中鉴定的ClanGV ODV蛋白总数占该病毒整个基因组ORF数目的60.2%,远远高于ChchNPV等其它杆状病毒。74个蛋白中的大部分成员集中分布于基因组的个两区域：一个是位于ORF7-ORF24之间的15个蛋白形成的蛋白簇(除去ORF10、ORF16和ORF21),另一个是位于ORF63-ORF91之间的24个蛋白形成的蛋白簇(除去ORF67、ORF75、ORF77、ORF80和ORF85)。这两个蛋白簇所包含的蛋白的数量分别占整个结构蛋白的20%和32%。将本研究结果和已鉴定的其它5种杆状病毒进行了比较。结果显示,有11个蛋白在已研究的杆状病毒中都被鉴定为ODV的蛋白：P49、PIF-2、P74、P6.9、P33、VP39、ODV-E27、VP91、vlf-1、GP41、 VP1054; 13个蛋白在已研究的杆状病毒中都被鉴定为ODV、BV或ODV/BV蛋白：P49、PIF-2、 ODV-EC43、P74、P6.9、38K、P33、VP39、ODV-E27、VP91、vlf-1、GP41和VP1054；12个蛋白只在GV的ODV中被鉴定：pep1、Clan22、Clan27、pep/p10、pep-2、Clan69、Clan83、Clan84、Clan90、 Clan94、Clan116和fgf-3。21种蛋白是本研究新鉴定的蛋白,它们是Clan17、Clan18、Clan20、P13、 Clan32、Clan37、Clan39、Clan42、P35、P47、P38.7、Clan63、Clan64、DBP、LEF-5、Clan79、TLP-20、 Clan93、Clan108、LEF-8和Clan117。这些新鉴定的蛋白大部分是功能未知蛋白,其中Clan42、Clan79和Clan93是ClanGV特有的ORF。没有鉴定到ODV-E66,在ClanGV基因组序列中也没有该蛋白的同源物。与ChchNPV一样,没有没有鉴定出DNA聚合酶(DNA polymerase)和解旋酶(Helicase),但它们在AcMNPV、HearSNPV和PiraGV中都被鉴定为ODV蛋白。为了利用Westernblot技术对这些蛋白进行进一步的验证,随机克隆了其中7个蛋白(ORF1629、 P49、ODV-E56、P13、SOD、P47和P40)的基因,目前3个蛋白(ORF1629、P49和SOD)已经得到表达和纯化。