研究背景乙型肝炎病毒(HBV,hepatitis B virus)感染呈世界性流行,是引起肝硬化、肝细胞癌(HCC,hepatocellular carcinoma)发生的主要原因之一,据世界卫生组织报道,全球有约20亿人曾感染过HBV,其中3.5亿人为慢性HBV感染,每年约有100万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和HCC。而我国是属HBV感染的地方性高流行区,据2006年的调查发现,我国60岁以下人群乙肝表面抗原(HBsAg,hepatitis B surface antigen)携带率为7.18%,5岁以下儿童的HBsAg携带率为0.96%,其中慢性乙型病毒性肝炎(CHB,chronic hepatitis B)患者约2000万例。其中每年死于HBV感染引起的终末期疾病者有近30万人,可以看出,对于CHB患者的治疗已刻不容缓。国内有关专家在参考国内外最新研究成果基础上,按照循证医学的原则,制定了《慢性乙型肝炎防治指南》,明确提出治疗CHB的总体目标:最大限度地抑制或消除HBV,减轻肝细胞炎症坏死及肝纤维化,延缓和阻止疾病进展,减少和防止肝病失代偿、肝硬化、HCC及其并发症的发生,从而改善患者生活质量,延长生存时间。慢性HBV感染的自然史分为四期:免疫耐受期、免疫清除期、低复制期或非活动期、再活动期。免疫清除期的特点:血清ALT水平波动,随之HBV DNA载量下降,血清HBeAg合成下降,抗-HBe产生增多,可能出现HBeAg血清学转换。研究表明,此期为抗病毒治疗的最佳时期,可获得较理想的治疗疗效。目前临床上治疗CHB的抗病毒药物主要是干扰素和核苷(酸)类似物(NAs,nucleos(t)ide analogues)。我国国家食品药品监督管理总局(CFDA,China Food and Drug Administration)批准的治疗CHB抗病毒药物有7种,包括普通干扰素α、聚乙二醇干扰素α、拉米夫定、阿德福韦酯、替比夫定、恩替卡韦及替诺福韦酯。NAs是通过阻断HBV前基因组RNA的反转录过程抑制HBV DNA复制,从而发挥抗病毒作用,但是却不能清除感染的肝细胞核中持续存在的共价闭合环状DNA(cccDNA,covalently closed circular DNA),停药后病毒再复制率高,因此需长期应用。而干扰素不仅有直接抑制病毒复制作用,同时亦可调控自然杀伤细胞(NK细胞)及细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞)活性,从而发挥免疫调控HBV感染的作用。干扰素因其具有双重抗病毒作用,故HBeAg血清学转换率和HBsAg清除率高,且其治疗时间短、停药后持续应答率高。CHB患者体内抗病毒免疫应答缺陷是导致HBV感染慢性化的主要原因之一。先前研究已经证实HBV特异性CTL细胞是清除HBV的主要免疫成分,然而持续的病毒复制导致HBV特异性T细胞功能的严重损伤,直接影响HBV的清除。干扰素的使用大大改善了 CHB患者的免疫功能,从而获得较好的持久应答率,降低肝硬化及HCC发生率,且提高患者的生存率。各大指南提出在有干扰素治疗适应症的前提下,推荐干扰素作为一线抗病毒药物。基线HBVDNA载量、ALT水平、HBV基因型、宿主IL-28B和治疗过程中HBsAg水平或HBsAg下降幅度等因素与抗病毒治疗疗效有关。研究表明,干扰素治疗24周时HBV DNA>106copies/mL的CHB患者,治疗结束后随访24周HBeAg血清学转换率不足20%,其内在机制尚未完全明确,目前考虑可能与病毒感染早期发生免疫逃逸有关,在治疗中阻断IFN诱导的信号传导途径,而影响HBV的清除。国内专家提出此类早期应答不佳患者联合NAs理论上不会影响后续治疗疗效,而且干扰素所致基础免疫状态发生改变可能会提高机体对NAs的应答,但是此方案并未得到广泛公认。本研究初步探讨干扰素治疗24周时应答不佳的慢乙肝患者的后续治疗疗效。研究中采用序贯加用NAs的治疗方法,期望能够获得较好的病毒学、血清学及生化学应答。既往有研究表明干扰素联合NAs抗病毒治疗疗效优于单药干扰素和(或)NAs治疗。在治疗CHB患者时,干扰素有较高的HBeAg血清学转换率,而NAs抑制HBV复制能力较强。所以,在干扰素治疗HBeAg阳性CHB患者24周病毒水平无明显下降时,是否可以加用一种NAs(除替比夫定,因两者联合可能有发生周围神经病变风险)以提高患者的应答率,但目前临床上对此方面的研究报道很少。同时,本研究也设立了继续干扰素单药治疗组、换用NAs组及直接停药组。通过比较治疗48周及72周时,各组之间的病毒学、血清学及生化学应答情况,而评价联合治疗组的治疗疗效。为慢性乙型病毒性肝炎患者的优化治疗方案提供理论依据。我们小组的前期研究亦发现干扰素治疗HBeAg阳性CHB患者的过程中,有25.2%患者出现HBeAg/抗-HBe同时阳性的现象,且这部分患者更易发生HBeAg血清学转换。抗病毒治疗过程中出现HBeAg/抗-HBe双阳性是否预示着能够获得更好的应答率?不同的治疗方案发生HBeAg/抗-HBe双阳性的临床特征有何差异?这些都需要深入研究予以阐明。研究目的:1、阐明干扰素治疗24周应答不佳的HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,加用核苷(酸)类似物(NAs)治疗48周后的疗效和安全性。2、阐明自发HBeAg/抗-HBe双阳性CHB患者的临床特征。3、阐明抗病毒治疗中HBeAg/抗-HBe双阳性CHB患者的临床特点和预后。研究方法:1、病例来源:1.1收集2010年9月至2014年12月南方医科大学南方医院感染内科住院或门诊的256例初治HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者,诊断符合2010年版慢性乙型肝炎防治指南。所有患者在干扰素单药治疗24周时,HBV DNA≥1.0×10~5 IU/mL 或 HBV DNA 下降≤21og10IU/mL。排除标准:(1)筛选前 6个月用过抗病毒药物或其他免疫调节剂者;(2)合并甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、巨细胞病毒、EB病毒或HIV感染者;(3)合并肝硬化、肝癌、妊娠、不稳定的糖尿病、甲状腺功能亢进、系统性红斑狼疮及严重的心脏、肾、内分泌、造血系统疾病和精神、神经疾病者。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会通过,并经患者知情同意。入组患者根据后续治疗方案分为4组:A组99例患者干扰素联用NAs治疗[58例联合恩替卡韦(ETV),41例阿德福韦(ADV)];B组52例患者继续干扰素单药治疗;C组70例患者换为NAs治疗;D组35例患者直接停止治疗。48周、72周分别评估生化学、病毒学、血清学应答率及不良反应情况(A、B、C三组均接受相应药物治疗72周,D组随访至72周)。1.2收集2008年9月至2014年12月在南方医科大学南方医院感染内科进行乙肝5项标志物检测,结果提示HBeAg/抗-HBe同时阳性的598例CHB患者,CHB的诊断符合2010年版慢性乙型肝炎防治指南。326例患者未曾接受抗病毒治疗(其中有165例患者在自发HBeAg/抗-HBe双阳性后接受抗病毒治疗),272例为接受抗病毒治疗患者。按照接受不同抗病毒治疗方案分为两组:接受干扰素治疗组,159例;接受核苷(酸)类似物治疗组,113例。比较两组患者临床特征及临床转归。2、检测方法:血清ALT采用Olympus AU5421全自动生化检测仪检测。血清HBV标志物检测(HBsAg、HBeAg、抗-HBe)采用雅培i2000免疫发光试剂检测仪检测(HBeAg相对定量S/CO值换算为国际检测标准的定量值PEIU/mL)。血清HBV DNA定量检测采用Roche lightcycler480荧光定量PCR仪(试剂由中山大学达安基因诊断试剂有限公司(中国)提供,检测下限为100IU/mL)。检测标本均为空腹静脉血血清。3、疗效判断:病毒学应答:HBVDNA阴转(<100IU/mL);血清学应答:HBeAg血清学转换,HBsAg阴转;生化学应答:ALT复常。4、安全性分析:观察接受治疗的患者用药后的不良反应、核苷(酸)类似物耐药变异的发生情况。5、统计方法:所有数据均采用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析。计量资料符合正态分布者用均数±标准差(mean±SD)表示,采用方差分析和t检验进行处理;不符合正态分布者用中位数(最小值,最大值)表示,采用秩和检验方法进行统计处理。计数资料用率描述,采用X~2检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果:1、256例干扰素治疗24周时应答不佳的HBeAg阳性CHB患者分为4组:A组,干扰素联用NAs;B组,继续单用干扰素;C组,换为NAs;D组,直接停药。各组患者的年龄(P=0.278)、性别比例(P=0.091),基线HBVDNA定量(P=0.379)、HBsAg 滴度(P=0.890)、HBeAg 滴度(P=0.262)、ALT 水平(P=0.963)及干扰素单药治疗24周时HBV DNA定量(P=0.065)、HBeAg滴度(P=0.650)、HBeAg滴度(P=0.692)、ALT水平(P=0.557)比较差异无统计学意义。其中直接停药组的35例患者,在停药后随访24周、48周时,HBVDNA载量、HBeAg滴度、HBsAg滴度及ALT水平均维持在较高水平,且均呈回升趋势,尤其以HBV DNA载量和ALT水平回升明显。其余3组患者在改变治疗方案后疗效对比结果得出,HBV DNA阴转率:48、72周时,A、C两组明显高于B组,差异有统计学意义(48W:X~2=22.566,P<0.001;X~2=22.657,P<0.001&72W:X~2=24.545,P<0.001;X~2=16.854,P<0.001);HBeAg血清学转换率:72周时,A组明显高于B、C 两组,差异有统计学意义(X~2=5.121,P=0.024;X~2=8.346,P=0.004);ALT复常率:48周、72周时,A、C两组与B组比较,差异有统计学意义(48W:X~2=6.782,P=0.009;X~2=7.800,P=0.005&72W:X~2=13.186,P<0.001;X~2=7.062,P=0.008)。联合治疗组中加用ETV与加用ADV组内比较结果:HBV DNA阴转率:48、72周时,加用 ETV 组均高于加用 ADV 组(48W:X~2=6.904,P=0.009&72W:X~2=11.990,P=0.001);而HBeAg血清学转换率及ALT复常率在治疗48周、72周时,加用ETV组与加用ADV组比较,差异无统计学意义。HBsAg阴转率:72周时,A组有10.1%发生HBsAg阴转,均为接受干扰素联合ETV治疗患者,而B组和C组无患者发生HBsAg阴转。2、598例CJB患者纳入HBeAg/抗-HBe双阳性研究。男性442例(73.9%),女性156例(26.1%),年龄(16～76)岁。其中326例为自发HBeAg/抗-HBe双阳性,272为治疗后HBeAg/抗-HBe双阳性。自发组患者中位年龄大于治疗组(34岁和29.5岁;Z=-4.415,P<0.001)。自发组发生HBeAg/抗-HBe双阳性时,有57 例(17.5%)发生 HBVDNA 阴转,而治疗组有 159 例(58.5%)(X~2=107.877,P<0.001);未发生HBVDNA阴转的患者,HBVDNA载量比较,差异有统计学意义(t=-5.908,P<0.001);自发组患者的HBeAg滴度、ALT水平明显高于治疗组(t=-2.774,P=0.006&t-4.929,P<0.001)。性别比例、HBsAg 滴度和抗-HBe滴度两组比较,差异无统计学意义(P=0.188,P=0.367,P=0.288)。3、自发组中有165例患者在发生HBeAg/HBeAb双阳性后,接受不同的抗病毒治疗方案,42例接受干扰素治疗,男性占71.4%;123例接受NAs治疗,男性占79.7%。~a干扰素组患者的中位年龄小于aNAs组(24岁和37岁;Z=-6.283,P<0.001),然而性别比例、治疗前HBV DNA阴转例数、HBsAg滴度、HBeAg滴度、抗-HBe滴度及ALT水平与NAs组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。截止到2014年12月,~a干扰素组患者的有27例(64.3%)发生HBeAg血清学转换,6例(14.3%)发生HBsAg阴转,明显高于aNAs组的39.8%和3.3%,差异有统计学意义(X~2=7.532,P=0.006&X~2=6.695,P=0.010);aNAs 组 HBV DNA阴转率明显高于~a干扰素组(57.1%和77.2%;X~2=6.287,P=0.012);然而,两组患者的ALT复常率比较,差异无统计学意义(85.7%和84.6%;X~2=0.033,P=0.856)。4、治疗组共纳入272例患者。~b干扰素组159例患者中PEG-IFNα 80例,IFNα79例;bNAs组113例患者中ETV81例,LDT32例。~b干扰素组患者治疗前性别、HBVDNA载量、HBsAg滴度、HBeAg滴度、抗-HBe滴度及ALT水平与bNAs组比较,差异均无统计学意义(P>0.05),但~b干扰素组患者的年龄明显小于bNAs组(P<0.001);组内各项指标比较,差异亦无统计学意义(P>0.05)。5、~b干扰素组和bNAs组首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性时,HBeAg滴度及HBeAb滴度,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05);而HBsAg滴度、ALT水平及HBVDNA阴转例数,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);其中未发生病毒学应答的患者HBV DNA水平分别为(4.37±1.29)log10IU/mL和(3.91±1.49)log10IU/mL,差异无统计学意义(=1.647,P=0.102)。组内比较分析结果:PEG-IFNα组和IFNα首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性时,HBeAg滴度、HBeAb滴度、HBsAg滴度、ALT水平及HBV DNA阴转例数,两组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。其中未发生病毒学应答的患者HBV DNA 水平分别为(4.38±1.47)log10IU/mL 和(4.36±1.10)log10IU/mL,差异亦无统计学意义(t=0.101,P=0.919)。ETV组和LDT组首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性时,HBeAg滴度、HBeAb滴度、HBsAg滴度、ALT水平及HBV DNA阴转例数,两组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。其中未发生病毒学应答的患者 HBV DNA 水平分别为(3.94±1.58)log10 IU/mL 和(3.81±1.34)log10 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.216,P=0.830)。6、治疗组患者出现双阳性及HBeAg血清学转换时间~b干扰素组和bNAs组首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性治疗时间中位数(范围)分别为 25.86(4.71～216.57)周和 42.86(6.29～235.43)周,发生 HBeAg 血清学转化的治疗时间中位数(范围)分别为55.14(9.00～284.14)周和113.43(40.86～215.57)周,差异均有统计学意义(Z=-4.473,P<0.001&Z=-5.794,P<0.001)。PEG-IFNα组和IFNα组首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性的治疗时间中位数(范围)分别为24.43(4.71～84.71)周和29.57(3.71～216.57)周,差异无统计学意义(Z=-1.099,P=0.272);而发生HBeAg血清学转化的治疗时间中位数(范围)分别为65.14(9.00～100.57)周和81.00(11.00～284.14)周,差异有统计学意义(Z=-3.888,P<0.001)。ETV组和LDT组首次出现HBeAg/抗-HBe双阳性治疗时间中位数(范围)分别为 42.71(7.43～235.43)周和 49.50(6.29～232.14)周,发生 HBeAg 血清学转化的治疗时间中位数(范围)分别为113.43(40.86～215.57)周和112.21(51.43～173.14)周,差异均无统计学意义(Z=-0.937,P=0.349&Z=-0.122,P=0.903)。7、治疗组患者疗效比较截止2014年12月,159例~b干扰素治疗的CHB患者中有79例(49.7%)发生HBeAg血清学转换,14例(8.8%)发生HBsAg阴转;bNAs组31例(27.4%)发生HBeAg血清学转换,无患者发生HBsAg阴转,两组比较,差异均有统计学意义(X~2=13.579,P<0.001;X~210.490,P=0.001);~b干扰素组 HBVDNA 阴转率明显低于bNAs组(59.7%和83.2%;X~2=17.113,P<0.001);两组患者的ALT复常率差异无统计学意义(P>0.05)。PEG-IFNα组发生HBeAg血清学转换率高于IFNα组(61.3%和39.0%;X~2=8.614,P=0.003),ETV 组有 22 例(27.2%)发生 HBeAg 血清学转换,与 LDT组相比,差异无统计学意义(X~2=0.011,P=0.918)。对14例HBsAg阴转患者进行分析,男性9例,女性5例,年龄(18～31)岁;基线时,HBVDNA载量<105IUml,HBsAg滴度<10,000IU/mL;治疗时间为(29.43～88.43)周,平均(59.74±19.93)周;发生HBeAg/抗-HBe双阳性时的治疗中位时间为24.12(4.71～28.03)周,HBVDNA平均阴转时间为(21.21±6.18)周;其中PEG-IFNα组有10例(12.5%),IFNα组有4例(5.1%),两组差异无统计学意义(X~2=2.738,P=0.098),可能与病例数较少有关。8.共有854例患者纳入安全性分析,未发生严重的不良事件。结论:1、干扰素治疗24周应答不佳时选择直接停药或继续干扰素单药治疗并不是好的临床选择;尤其是选择直接停药的患者,HBV DNA载量及ALT水平均有明显回升,可能会加速肝脏疾病的进展。2、加用核苷(酸)类似物或换为核苷(酸)类似物治疗可有效抑制HBV DNA复制,改善肝脏功能。3、随着治疗时间的延长,干扰素加用核苷(酸)类似物治疗可能会获得更高的HBeAg血清学转换率;且干扰素加用ETV可能有更高的HBsAg阴转率。44、无论是自发出现还是抗病毒治疗过程中出现HBeAg/抗-HBe双阳性的CHB患者,干扰素治疗后最终发生HBeAg/抗-HBe血清学转换率和HBsAg阴转率均高于NAs组。5、早期病毒学应答和HBeAg/抗-HBe双阳性可能是获得HBsAg阴转的联合预测因素。