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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是目前引起世界养猪业严重经济损失的最重要病原之一,但病毒感染和致病机制尚不十分清楚。PRRSV基因组编码6个结构蛋白和14个非结构蛋白(Nsps),其中,Nsp4具有丝氨酸蛋白酶活性,负责Nsp3-Nspl2的加工和切割,在PRRSV侵染宿主和复制过程中具有重要作用。本研究采用大肠杆菌表达系统获得纯化Nsp4和Nsp12蛋白,免疫小鼠后制备获得特异性多克隆抗体。同时,通过构建PRRSV不同毒力毒株Nsps真核表达质粒,测定其抑制IFN-β启动子活性作用；构建了转录因子IRF3真核表达质粒,从IRF3支路分析观察Nsp4对IFN-p启动子活性的影响,证明Nsps对IFN-β没有抑制作用,为阐明PRRSV免疫抑制作用奠定了基础。具体研究包括：1. PRRSV Nsp4和Nsp12抗体制备与鉴定本研究将PRRSV非结构蛋白Nsp4基因和Nsp12基因分别克隆至原核表达载体pET32a(+)和pGEX-6P-1,转化至BL21以IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定结果显示,Nsp4和Nsp12分别以可溶性蛋白和包涵体形式表达,大小分别为42ku和44ku,均具有良好的反应原性。经过Ni-NTA镍离子亲和层析和包涵体洗液纯化,获得纯化重组蛋白,分别免疫BALB/c小鼠制备抗血清,、Vestern-blot和IFA结果显示,制备的抗血清均与PRRSV发生特异性反应,ELISA效价达到1：32000。该抗体可用于PRRSVNsp4和Nsp12生物学功能研究。2.PRRSV Nsp4对IFN-β启动子活性的影响有研究报道,PRRSV Nspl, Nsp2. Nsp4和Nsp11有抑制I型干扰素的活性,其中,Nspl、Nsp2和Nsp11抑制I型干扰素的机制研究较多,而Nsp4抑制I型干扰素作用尚未有详细研究。本研究首先采用pEGFP-N1表达质粒,构建PRRSV NT0801毒株10个Nsp的重组表达质粒pEGFP-NTNsp s,转染BHK21和Hela细胞,荧光显微镜观察和Westernblot结果证明其均获得表达。然后采用IFN-β启动子活性双荧光素酶报告基因系统检测方法,将pEGFP-NTNsps转染Hela细胞后,在po1y(I：C)刺激下,Nsp1、Nsp2和Nsp11蛋白能显著抑制IFN-p启动子活性(P<0.001),但Nsp4对IFN-p启动子活性没有影响；再用pcDNA3.1载体构建表达强毒株BB0907、中毒株NT0801和弱毒株S1的Nsp4, Wstern blot鉴定其正确表达后,转染Hela/Marc-145细胞,在poly(I:C)诱导下,对IFN-p启动子的活性没有影响。最后,用pcDNA3.1载体表达不同毒株的N sp4, Wstern blot鉴定其正确表达后,转染Hela/Marc-145细胞,在IRF3诱导下对IFN-p启动子的活性也没有影响。该研究结果表明,PRRSV Nsp4没有免疫抑制作用,与其它研究报道的结果不同,对阐明PRRSV免疫抑制作用有重要作用。