黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1, AFB1）是由真菌代谢产生的具有强致癌性的剧毒物质，广泛存在于粮食、油料及坚果等食物中。鉴于AFB1的巨大危害，各国普遍加强对AFB1的监管。目前，用于检测AFB1的方法主要包括薄层层析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法以及电化学传感器等。这些方法存在一定的不足，如灵敏度较低、检测成本较高、耗时长、检测结果可靠性较差以及检测试剂易对人体造成伤害和对生态环境造成污染等。针对上述不足，本研究制备了AFB1非标记免疫阻抗传感器，以期达到灵敏、快速、检测结果更加可靠的目的；同时，本研究将抗独特型纳米抗体应用于AFB1的分子模拟研究中，以期替代AFB1进行免疫学分析，防止AFB1对操作人员造成伤害和对环境造成污染。主要研究内容如下：1AFB1非标记免疫阻抗传感器的研究1.1采用电化学恒电流聚合法于玻碳电极表面合成纳米复合物PPy/PPa/rGO。优化了聚合电解质中Py、Pa单体和rGO的最佳浓度，分别为0.26M，0.065M和16μg/mL；最佳的电化学聚合时间为300s。分别通过循环伏安法、电化学阻抗谱、扫描电子显微镜等技术表征了纳米复合物PPy/PPa/rGO，结果表明，以最佳条件合成的纳米复合物PPy/PPa/rGO具有较好的电化学氧化还原活性、电化学稳定性和独特的形貌。1.2采用EDC/NHS将抗AFB1单克隆抗体共价偶联于电极表面，制备了AFB1免疫阻抗传感器。该传感器不需要对抗原或抗体进行酶标记；检测时间为50min，最低检测限为8fg/mL，线性范围为10fg/mL-10pg/mL；与AFB2、AFG1、AFG2的交叉反应率分别为2%、27%和21%，与呕吐毒素、赭曲霉毒素A无明显交叉反应；对玉米样品的加标回收率为80.0±5.0%-112.0±2.5%。该结果表明，PPy、PPa和rGO三者的协同作用，增强了纳米复合物PPy/PPa/rGO的电化学活性和稳定性，提高了传感器的检测灵敏度；此外，该传感器在阻抗测试中，无需外源氧化还原探针，在PBS中即可进行电化学阻抗谱分析，使检测结果更加可靠。2独特型纳米抗体应用于AFB1分子模拟的研究2.1采用抗AFB1单克隆抗体F(ab′)2片段免疫羊驼，提取羊驼淋巴细胞总RNA，通过反转录PCR和巢式PCR构建了AFB1独特型纳米抗体文库。该文库目的基因插入率为90.9%，实际库容量达到1.8×108，文库多样性较好。辅助噬菌体救援后，噬菌体展示文库滴度达到1×1013cfu/mL，可以用于后续的亲和淘选。2.2分别以抗AFB1单克隆抗体及其F(ab′)2片段为靶标进行固相亲和淘选。在以抗AFB1单克隆抗体全抗体为靶标淘选时，分别采用Gly-HCl (pH2.2)洗脱法和AFB1抗原竞争洗脱法洗脱特异性结合的噬菌体，其中采用Gly-HCl洗脱法的淘选中，第三轮验证结果显示特异性噬菌体的比例达到该轮验证总数的22.9%，而AFB1抗原竞争洗脱法第二轮得到的特异性噬菌体即达到该轮验证总数的27.1%，表明抗原竞争洗脱法在筛选抗独特型噬菌体时具有较高的效率。此外，以抗AFB1单克隆抗体F(ab′)2片段为靶蛋白进行亲和淘选，第二轮验证得到的特异性噬菌体占该轮验证总数的16.7%。多序列比对发现，得到的特异性噬菌体抗体氨基酸序列同源性较高。2.3将独特型纳米抗体基因克隆至原核表达载体进行诱导表达，经蛋白质复性后得到可溶性抗体蛋白，分别采用竞争ELISA和生物学方法鉴定该抗体的生物学活性。结果表明，m7蛋白不但能与AFB1竞争结合抗AFB1单克隆抗体，还能诱发Balb/c小鼠产生抗AFB1多抗血清，因此，m7属于半抗原抑制型独特型抗体，有望替代AFB1进行免疫学研究。