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研究背景：
PTK7是一种缺乏催化活性的受体蛋白酪氨酸激酶，能与相应配体结合(即二聚化)、并自身磷酸化激活下游一系列级联传递并调控细胞增殖、分化及凋亡。目前研究发现，PTK7在急性髓细胞性白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌以及卵巢癌中高表达，靶向PTK7的抗体治疗可以明显降低肿瘤起始细胞并持续促进肿瘤改善,因此推断肿瘤的发生发展可能和PTK7过表达有关。
研究显示，PTK7过表达能促进食管鳞癌细胞的侵袭转移，同时PTK7的高表达抑制了肿瘤的放疗敏感性。前期研究中，我们通过免疫化学染色的方法验证了食管鳞癌组织和癌旁组织中PTK7的表达情况，发现PTK7在癌组织中高表达于细胞膜，而癌旁组织中基本不表达或者低表达。但是PTK7在食管鳞癌中的作用机理尚不十分清楚，因此有必要对PTK7在食管鳞癌中的生物学作用及其分子机制进行深入探讨。
本课题拟首先通过免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织及癌旁正常组织中PTK7的表达，明确PTK7的表达与食管鳞癌相关性，随后通过在食管鳞癌细胞中过表达/沉默表达PTK7基因，深入探讨PTK7对食管鳞癌细胞增殖凋亡和侵袭迁移等的生物学影响，并通过一系列的实验研究其调控细胞增殖凋亡的具体信号机制，为食管鳞癌的发病机制、生物治疗等提供实验依据。
研究目的：
探讨PTK7与食管鳞癌侵袭转移的分子机制，初步揭示食管鳞癌的发生、浸润和转移的理论基础，探索PTK7调控食管癌细胞侵袭迁移和增殖凋亡的具体机制。
研究方法：
1.PTK7在食管鳞癌中的表达情况及其过表达对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移、EMT等影响。
(1)收集临床病例食管鳞癌组织及对应的癌旁组织标本，通过免疫组织化学染色的方法检测肿瘤组织和正常组织中PTK7的表达差异。
(2)在TE-1细胞中通过逆转录PCR获取PTK7目的基因，再利用pcDNA3.1质粒构建pcDNA3.1-PTK7重组质粒。
(3)利用PTK7过表达重组质粒转染人食管癌细胞株TE-1，构建PTK7稳定表达的细胞系。
(4)应用WestemBlot法检测PTK7蛋白在TE-1中表达情况。
(5)通过划痕实验、集落形成实验、Transwell实验、流式细胞术等明确PTK7在细胞侵袭的作用。
(6)WestemBlot检测PTK7过表达对上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的影响。
2.PTK7沉默表达对食管鳞癌细胞食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移、EMT等影响。
(1)利用siRNA干扰TE-1细胞内的PTK7的表达PTK7表达,用WestemBlot法验证干扰效果。
(2)通过CCK8、划痕实验实验检测siRNA干扰后对TE-1细胞的生长增值能力影响，平板克隆形成实验检测干扰后对TE-1细胞的克隆形成能力影响，流式细胞术检测干扰后对TE-1细胞凋亡影响，Transwell迁移及侵袭实验检测对侵袭及迁移能力能力影响。
(3)WestemBlot检测PTK7沉默表达对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的影响。
3.PTK7调控食管鳞癌细胞增殖凋亡的分子机制
(1)采用荧光定量PCR检测siRNA沉默PTK7表达后，对TE-1细胞凋亡相关因子的表达影响，得到PTK7通过调控TP53基因的表达参与食管癌细胞凋亡的调控。
(2)WestemBlot检测PTK7过表达和沉默表达对P38和JNK蛋白的表达影响。
(3)荧光定量PCR和WesternBlot检测PTK7对MKK3和MKK6的表达影响。
(4)流式细胞术检测同时沉默PTK7和MKK3对细胞凋亡的影响。
4.统计学分析
采用SPSS22.0统计学软件进行分析，以均数±标准差(-x±s)表示，组间差异采用t检验和方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
1.68例食管鳞状细胞癌组织中57例PTK7的表达阳性，32例癌旁组织(包括正常组织细胞及不典型细胞增生)中仅有2例PTK7表达阳性，PTK7表达有统计学意义(P<0.001)。TE-1细胞中提取总RNA后，通过逆转录获取目的基因，然后通过双酶切反应得到pcDNA3.1-PTK7重组质粒。
2.Western验证重组质粒转染后PTK7蛋白稳定表达在TE-1细胞中，表明PTK7重组质粒构建成功。
3.PTK7过表达对食管鳞癌细胞增殖、侵袭迁移、凋亡及EMT影响明显。
(1)集落形成实验、划痕实验表明PTK7过表达的TE-1细胞的增值能力明显高于对照细胞.
(2)Transwell实验表明过表达PTK7的TE-1细胞穿过Matrigel聚碳酸酶膜的数目明显多于对照细胞，证明PTK7过表达能够促进食癌细胞的侵袭转移能力。
(3)流式细胞术表明PTK7过表达后凋亡能力明显减弱。证明PTK7在细胞中抑制凋亡作用。
(4)WesternBlot结果表明在PTK7的过表达能够使N-cadherin和Vimentin的表达上升，而使E-cadherin的表达下降，结果提示PTK7可能促进食管上皮细胞发生EMT。
4.PTK7沉默表达对食管鳞癌细胞增殖、侵袭迁移、凋亡及EMT相关蛋白有重要影响。
(1)CCK8实验、集落形成实验、划痕实验表明siRNA干扰后TE-1细胞的增值能力明显低于对照细胞。
(2)Transwell实验表明siRNA干扰后TE-1细胞的侵袭转移能力减弱，反向证明了PTK7促肿瘤作用。
(3)流式细胞术表明siRNA干扰后TE-1细胞凋亡能力明显增强。反向证明PTK7具有抑制凋亡的作用。
(4)WesternBlot结果表明PTK7沉默表达能够使N-cadherin和Vimentin的表达下降，而使E-cadherin的表达上升，反向提示PTK7蛋白可能参与食管癌的EMT发生过程。
Vimentin的表达下降，而使E-cadherin的表达上升，反向提示PTK7蛋白可能参与食管癌的EMT发生过程。
5.PTK7通过MKK3/P38/P53信号途径调控食管癌细胞的凋亡。
(1)荧光定量PCR结果显示，食管鳞癌细胞中沉默PTK7表达后，P53基因的表达显著升高。
(2)WesternBlot表明，沉默PTK7可引起P38磷酸化水平的升高，而过表达PTK7则可以引起P38磷酸化水平的显著降低，但是PTK7的表达变化对非磷酸化的P38及JNK和磷酸化JNK基本没有影响。
(3)荧光定量PCR和WesternBlot表明，MKK3mRNA的相对表达量在沉默和过表达PTK7的食管鳞癌细胞中分别显著升高和显著降低，而MKK6的表达基本没有变化。
(4)WesternBlot结果表明，TE-1细胞中，沉默PTK7后可以显著升高P53-Ser15蛋白表达的影响，而过表达PTK7则可以显著抑制P53-Ser15蛋白的表达。
(5)WesternBlot实验证实，p53-ser15的表达受到MKK3和PTK7的调控。
(6)流式细胞检测提示，PTK7对细胞凋亡影响可能是通过MKK3作用的。
结论：
1.PTK7在食管鳞癌癌组织中的表达水平显著高于其正常的癌旁组织，表明PTK7的高表达与食管鳞癌发生密切相关。
2.PTK7在促进食管鳞癌侵袭转移过程中扮演着重要作用，对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移等生物学行为具有重要影响。
3．PTK7对食管鳞癌上皮间质转化途径有促进作用，但其具体机制仍需进一步研究。
4.PTK7在食管鳞癌中抑制细胞凋亡可能是通过MKK3/P38/P53信号途径进行调控的。
PTK7是一种缺乏催化活性的受体蛋白酪氨酸激酶，能与相应配体结合(即二聚化)、并自身磷酸化激活下游一系列级联传递并调控细胞增殖、分化及凋亡。目前研究发现，PTK7在急性髓细胞性白血病、结肠癌、非小细胞肺癌、乳腺癌以及卵巢癌中高表达，靶向PTK7的抗体治疗可以明显降低肿瘤起始细胞并持续促进肿瘤改善,因此推断肿瘤的发生发展可能和PTK7过表达有关。
研究显示，PTK7过表达能促进食管鳞癌细胞的侵袭转移，同时PTK7的高表达抑制了肿瘤的放疗敏感性。前期研究中，我们通过免疫化学染色的方法验证了食管鳞癌组织和癌旁组织中PTK7的表达情况，发现PTK7在癌组织中高表达于细胞膜，而癌旁组织中基本不表达或者低表达。但是PTK7在食管鳞癌中的作用机理尚不十分清楚，因此有必要对PTK7在食管鳞癌中的生物学作用及其分子机制进行深入探讨。
本课题拟首先通过免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织及癌旁正常组织中PTK7的表达，明确PTK7的表达与食管鳞癌相关性，随后通过在食管鳞癌细胞中过表达/沉默表达PTK7基因，深入探讨PTK7对食管鳞癌细胞增殖凋亡和侵袭迁移等的生物学影响，并通过一系列的实验研究其调控细胞增殖凋亡的具体信号机制，为食管鳞癌的发病机制、生物治疗等提供实验依据。
研究目的：
探讨PTK7与食管鳞癌侵袭转移的分子机制，初步揭示食管鳞癌的发生、浸润和转移的理论基础，探索PTK7调控食管癌细胞侵袭迁移和增殖凋亡的具体机制。
研究方法：
1.PTK7在食管鳞癌中的表达情况及其过表达对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移、EMT等影响。
(1)收集临床病例食管鳞癌组织及对应的癌旁组织标本，通过免疫组织化学染色的方法检测肿瘤组织和正常组织中PTK7的表达差异。
(2)在TE-1细胞中通过逆转录PCR获取PTK7目的基因，再利用pcDNA3.1质粒构建pcDNA3.1-PTK7重组质粒。
(3)利用PTK7过表达重组质粒转染人食管癌细胞株TE-1，构建PTK7稳定表达的细胞系。
(4)应用WestemBlot法检测PTK7蛋白在TE-1中表达情况。
(5)通过划痕实验、集落形成实验、Transwell实验、流式细胞术等明确PTK7在细胞侵袭的作用。
(6)WestemBlot检测PTK7过表达对上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的影响。
2.PTK7沉默表达对食管鳞癌细胞食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移、EMT等影响。
(1)利用siRNA干扰TE-1细胞内的PTK7的表达PTK7表达,用WestemBlot法验证干扰效果。
(2)通过CCK8、划痕实验实验检测siRNA干扰后对TE-1细胞的生长增值能力影响，平板克隆形成实验检测干扰后对TE-1细胞的克隆形成能力影响，流式细胞术检测干扰后对TE-1细胞凋亡影响，Transwell迁移及侵袭实验检测对侵袭及迁移能力能力影响。
(3)WestemBlot检测PTK7沉默表达对E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的影响。
3.PTK7调控食管鳞癌细胞增殖凋亡的分子机制
(1)采用荧光定量PCR检测siRNA沉默PTK7表达后，对TE-1细胞凋亡相关因子的表达影响，得到PTK7通过调控TP53基因的表达参与食管癌细胞凋亡的调控。
(2)WestemBlot检测PTK7过表达和沉默表达对P38和JNK蛋白的表达影响。
(3)荧光定量PCR和WesternBlot检测PTK7对MKK3和MKK6的表达影响。
(4)流式细胞术检测同时沉默PTK7和MKK3对细胞凋亡的影响。
4.统计学分析
采用SPSS22.0统计学软件进行分析，以均数±标准差(-x±s)表示，组间差异采用t检验和方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
研究结果：
1.68例食管鳞状细胞癌组织中57例PTK7的表达阳性，32例癌旁组织(包括正常组织细胞及不典型细胞增生)中仅有2例PTK7表达阳性，PTK7表达有统计学意义(P<0.001)。TE-1细胞中提取总RNA后，通过逆转录获取目的基因，然后通过双酶切反应得到pcDNA3.1-PTK7重组质粒。
2.Western验证重组质粒转染后PTK7蛋白稳定表达在TE-1细胞中，表明PTK7重组质粒构建成功。
3.PTK7过表达对食管鳞癌细胞增殖、侵袭迁移、凋亡及EMT影响明显。
(1)集落形成实验、划痕实验表明PTK7过表达的TE-1细胞的增值能力明显高于对照细胞.
(2)Transwell实验表明过表达PTK7的TE-1细胞穿过Matrigel聚碳酸酶膜的数目明显多于对照细胞，证明PTK7过表达能够促进食癌细胞的侵袭转移能力。
(3)流式细胞术表明PTK7过表达后凋亡能力明显减弱。证明PTK7在细胞中抑制凋亡作用。
(4)WesternBlot结果表明在PTK7的过表达能够使N-cadherin和Vimentin的表达上升，而使E-cadherin的表达下降，结果提示PTK7可能促进食管上皮细胞发生EMT。
4.PTK7沉默表达对食管鳞癌细胞增殖、侵袭迁移、凋亡及EMT相关蛋白有重要影响。
(1)CCK8实验、集落形成实验、划痕实验表明siRNA干扰后TE-1细胞的增值能力明显低于对照细胞。
(2)Transwell实验表明siRNA干扰后TE-1细胞的侵袭转移能力减弱，反向证明了PTK7促肿瘤作用。
(3)流式细胞术表明siRNA干扰后TE-1细胞凋亡能力明显增强。反向证明PTK7具有抑制凋亡的作用。
(4)WesternBlot结果表明PTK7沉默表达能够使N-cadherin和Vimentin的表达下降，而使E-cadherin的表达上升，反向提示PTK7蛋白可能参与食管癌的EMT发生过程。
Vimentin的表达下降，而使E-cadherin的表达上升，反向提示PTK7蛋白可能参与食管癌的EMT发生过程。
5.PTK7通过MKK3/P38/P53信号途径调控食管癌细胞的凋亡。
(1)荧光定量PCR结果显示，食管鳞癌细胞中沉默PTK7表达后，P53基因的表达显著升高。
(2)WesternBlot表明，沉默PTK7可引起P38磷酸化水平的升高，而过表达PTK7则可以引起P38磷酸化水平的显著降低，但是PTK7的表达变化对非磷酸化的P38及JNK和磷酸化JNK基本没有影响。
(3)荧光定量PCR和WesternBlot表明，MKK3mRNA的相对表达量在沉默和过表达PTK7的食管鳞癌细胞中分别显著升高和显著降低，而MKK6的表达基本没有变化。
(4)WesternBlot结果表明，TE-1细胞中，沉默PTK7后可以显著升高P53-Ser15蛋白表达的影响，而过表达PTK7则可以显著抑制P53-Ser15蛋白的表达。
(5)WesternBlot实验证实，p53-ser15的表达受到MKK3和PTK7的调控。
(6)流式细胞检测提示，PTK7对细胞凋亡影响可能是通过MKK3作用的。
结论：
1.PTK7在食管鳞癌癌组织中的表达水平显著高于其正常的癌旁组织，表明PTK7的高表达与食管鳞癌发生密切相关。
2.PTK7在促进食管鳞癌侵袭转移过程中扮演着重要作用，对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、侵袭迁移等生物学行为具有重要影响。
3．PTK7对食管鳞癌上皮间质转化途径有促进作用，但其具体机制仍需进一步研究。
4.PTK7在食管鳞癌中抑制细胞凋亡可能是通过MKK3/P38/P53信号途径进行调控的。