【摘 要】
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【目的】探讨黄连碱联合仑伐替尼对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并基于基因芯片技术探讨黄连碱影响仑伐替尼对肝癌生物学效应的作用基因,并对靶基因的功能进行了验证,为进一步研究其机制提供依据。【方法】首先通过MTT法检测黄连碱和甲磺酸仑伐替尼对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50);确定甲磺酸仑伐替尼的使用浓度,并且筛选出黄连碱的适配浓度。通过CCK-8实验黄连碱和甲磺酸仑伐替尼联
【基金项目】
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项目名称:蛭岩消积方院内制剂研制开发，项目合同编号:桂科AB18126066，项目来源:广西科技项目计划，项目起止时间:2019.01-2021.12；
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【目的】探讨黄连碱联合仑伐替尼对肝癌细胞增殖和凋亡的影响,并基于基因芯片技术探讨黄连碱影响仑伐替尼对肝癌生物学效应的作用基因,并对靶基因的功能进行了验证,为进一步研究其机制提供依据。【方法】首先通过MTT法检测黄连碱和甲磺酸仑伐替尼对人肝癌Huh-7细胞增殖的抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50);确定甲磺酸仑伐替尼的使用浓度,并且筛选出黄连碱的适配浓度。通过CCK-8实验黄连碱和甲磺酸仑伐替尼联用干预48h对人肝癌Huh-7细胞增殖活性的影响;通过流式细胞术实验检测双药联用对肝癌Huh-7细胞凋亡的影响。单用仑伐替尼、黄连碱和双药联用干预Huh-7细胞48h后,提取细胞总RNA,利用基因芯片技术,研究干预前后基因表达谱变化。以|Fold Change|≥1.3且FDR＜0.05为筛选标准,筛选干预前后在单药组和双药组均下调的差异基因;通过RT-PCR法对表达丰度下调的10个差异基因表达进行验证。运用高内涵筛选（HCS）技术进一步筛选黄连碱影响仑伐替尼对人肝癌细胞生物学功能的潜在作用基因。通过RNA干扰技术构建靶基因的沉默序列,转染Huh-7细胞。基因沉默细胞系构建成功后,用单药组和双药组继续干预48h,通过CCK-8实验、流式细胞学实验、伤口愈合实验和侵袭实验验证差异基因沉默对单用仑伐替尼和仑伐替尼与黄连碱联用在调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。【结果】（1）甲磺酸仑伐替尼对肝癌Huh-7细胞的IC50为13.71μM,而黄连碱的IC50为39.55μM;确定甲磺酸仑伐替尼的使用浓度为10μM,并且筛选出黄连碱的适配浓度为40μM。（2）相比于单药组,黄连碱搭配甲磺酸仑伐替尼更能显著降低肝癌Huh-7细胞的增殖活性。（3）相比于单药组,黄连碱搭配甲磺酸仑伐替尼更能显著促进人肝癌Huh-7细胞的凋亡。（4）单药组和双药组干预肝癌Huh-7影响细胞基因表达谱,共筛选出51个差异基因,以下调基因作为研究对象,筛选出10个有潜力的差异基因。（5）RT-PCR结果显示,包括CDCA8、CDKN2C和LMNB1在内的10个待研细胞表达量均为高。（6）HCS实验进一步筛选出CDKN2C可能是黄连碱增效的作用基因。（7）CDKN2C沉默能促进单用仑伐替尼组和双药联用组对肝癌Huh-7细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,并提高了肝癌Huh-7细胞的凋亡率,并且双药联用组比单用仑伐替尼组的上述效应更加突出,差异有统计学意义。【结论】1.黄连碱可以增强仑伐替尼抑制肝癌细胞增殖及促进肝癌细胞凋亡的作用。2.黄连碱增强仑伐替尼对肝癌细胞生物学效应与其作用于CDKN2C密切相关,其作用机制有待深入研究。
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