论文部分内容阅读
苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)是一种新型生物防腐剂,乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase, LDH)是乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)中转化苯丙酮酸(phenypyrubvate, PPA)生成苯乳酸的主要酶。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY)中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种工具,结合其他生物信息学分析软件,如ClustalX、VMD等,从数据库中得到副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶基因,分析、预测该基因编码的蛋白理化性质、翻译后的修饰位点、拓扑结构、二级结构、三级结构和功能域。并与其他微生物的乳酸脱氢酶蛋白序列进行比对,得出它们的保守序列。得出该基因编码335个氨基酸,其蛋白理论分子质量为36608.8,预测该蛋白有三个跨膜区。与干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶进化关系最近。应用生物信息方法预测得到副干酪乳杆菌的乳酸脱氢酶的结构与功能方面的信息,为我们进一步开展本实验室副干酪乳杆菌W2(LactobacillusparacaseiW2)的LDH有关研究提供了理论依据,同时对我们以后克隆表达有活性的LDH蛋白提供帮助。以副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)基因组DNA为模板,根据GeneBank中已公布的副干酪乳杆菌乳酸脱氢酶基因ldh序列设计引物,PCR扩增乳酸脱氢酶(ldh)基因并连接到pMD19-T简易载体中。测序结果表明:副干酪乳杆菌W2基因长度为1008bp。与GeneBank中L.paracasei subsp. Paracasei的LDH蛋白基因序列同源性为99.6%,氨基酸序列同源性100%,说明ldh基因在副干酪乳杆菌中是非常保守的。将双酶切后的目的基因与pET-22b(+)连接,构建成重组质粒pET22b-ldh导入E. coliBL21(DE3)感受态细胞中诱导表达目的蛋白LDH。经SDS-PAGE分析可见约37kD的与预期大小一致的目的蛋白条带,酶活分析产物的粗提液酶活力为74.5U/mL,表明ldh基因表达产物具有生物活性。LDH最适温度为50℃,最适pH为6.0,热稳定性较好。LDH对苯丙酮酸的Km为2.512mM。