人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是引起艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrom, AIDS)的病原。目前，艾滋病的流行已经严重威胁到人类的健康和发展，从历史经验和长远考虑，发展安全、有效的疫苗是预防和控制艾滋病的根本途径和有效措施之一。 考虑到安全性，用于临床试验的疫苗株都要求不带筛选标记。活载体疫苗能够以天然的方式加工和合成抗原并呈递给免疫系统，从而诱导较强的细胞免疫和体液免疫应答。密码子优化可以明显提高抗原的表达量及DNA疫苗免疫反应的强度。以痘苗病毒为载体的活载体疫苗已经进入临床试验并取得一定效果。本研究的目的是基于我国HIV-1主要流行株B’／C重组株CN54，构建两株不带筛选标记的多价重组痘苗病毒疫苗株，并与相应的DNA疫苗联合免疫BALB／c小鼠，从而探讨其诱发的HIV特异性免疫应答。同时设立平行实验组，比较HIV密码子优化的合成基因野生型基因诱导的细胞免疫和体液免疫应答之间是否存在差异，为我国艾滋病疫苗的临床试验提供参考。 本实验首先构建了含有neo基因和lacZ基因双重筛选标记的转移质粒pV175将HIV-I中国主要流行株B’／C重组株CN54gagpol基因置于pV175的启动子pE／L下，构建重组质粒pV175-gagpol；将HIV合成抗原基因syngpnef和syngp120分别克隆到pV175的启动子pE／L下游，构建了重组转移质粒pV175-syngpnef-syngp120。重组质粒在鸡胚细胞内与痘苗病毒发生同源重组，使HIV目的基因与含neo基因和lacZ基因的双重筛选标记一同重组到痘苗病毒基因组DNA的TK区中。前三轮在G418加压筛选后，用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，这样就可以挑取既含有目的基因又含筛选标记的蓝色重组痘苗病毒：接着在无G418压力选择下，蓝色重组痘苗病毒自身会因为转移质粒中HIV目的基因上游一小段约200bp的lacZ’片段与完整的lacZ基因发生分子内的同源重组，从而丢失neo基因和lacZ基因而得到只含目的基因的重组痘苗病毒。用加有X-gal和中性红的低熔点琼脂糖铺斑，能挑取只含有目的基因的白色重组病毒。挑取的白色重组病毒纯化三代，就能得到单一克隆的重组病毒疫苗株。结果显示，成功筛选到了两株重组痘苗病毒，分别命名为rVV-gagpol和rVV-syngpnef-syngp120。经PCR和Dot blot检测，确认这两株重组痘苗病毒的neo基因和lacZ基因均己丢失；PCR鉴定表明目的基因已插入重组痘苗病毒的基因组中；抗体染色和Western blot结果证实这两株重组痘苗病毒都能很好的表达HIV目的蛋白。 免疫策略是影响免疫效果的重要因素之一。本实验采用DNA疫苗初免，重组痘苗病毒加强的Prime-boost免疫策略。先用相应的DNA疫苗免疫3次，再用所构建的重组痘苗病毒加强免疫1次，比较各实验组小鼠诱导的可能免疫应答情况，同时进一步分析比较免疫含HIV野生型抗原基因和合成抗原基因的疫苗后，在小鼠中诱导的免疫应答是否存在差异。间接ELISA法测定Gag和Env特异性结合抗体；间 华中农业大学生命科学技术学院硕士学位论文接ELISA法检测Gag特异性IgGZa/IgGI，以确定诱导的免疫应答类型;流式细胞仪检测细胞内分泌IFN一Y的HIV-1特异性CDS+T淋巴细胞，以评价细胞免疫反应水平。结果显示，各实验组小鼠均诱导了较强的HIV特异性体液和细胞免疫应答，并且倾向Thl型的细胞免疫应答。带有野生型抗原基因的gagPul组诱导出了较高的体液免疫应答，带有合成抗原基因的syngPnef-syngP12o组诱导出了较高的细胞免疫应‘答。统计学分析表明，各组之间都不存在显著性差异。 综上所述，本研究成功构建了转移质粒载体pVI75。通过该质粒载体所建立的重组痘苗病毒疫苗株筛选平台具有工作量小、周期短等优点，大大提高了我国HW活载体候选疫苗的研制效率。通过该平台，本研究成功构建了两株不带筛选标记的多价重组痘苗病毒疫苗株rVV*gagpol和rVV-syngpnef-syngp12o，分别表达HIV-I中国主要流行株B’/c重组株CN54的野生型抗原基因和合成抗原基因，为我国艾滋病疫苗的临床试验提供重要候选疫苗。动物免疫结果说明，rvV-gagPol和rvV-syngPnef-syngP120与相应的DNA疫苗联合免疫小鼠，能够诱导较强的体液和细胞免疫应答，为下一步的非人灵长类动物实验提供参考。