牛流行热(Bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(Bovine ephemeral fever virus，BEFV)引起的牛和水牛的急性热性传染病。它广泛流行于亚洲、非洲和大洋洲许多国家和地区。本病的死亡率较低，大部分发病牛均能康复，但由于发病率高，对于奶牛产奶量和役牛使役能力有极大的影响，给养牛业造成巨大的经济损失。BEFV属弹状病毒科暂时热病毒属(Ephemeral virus)成员，共有5个结构蛋白，其中G蛋白是BEFV主要免疫原性蛋白。以G蛋白制成的亚单位疫苗免疫牛，可使牛产生对强毒的抵抗力。因而，G蛋白基因是构建BEFV基因工程疫苗的首选基因。 白细胞介素-2(IL-2)是由辅助性T淋巴细胞(Helper T cell)分泌的一种T细胞生长因子，具有许多生物活性。以重组IL-2作为免疫增强剂可能是解决目前众多疫苗效果不良或不稳定问题的有效途径之一，是被人们普遍看好并有着广阔应用前景的新型佐剂。 为研制BEFV基因工程疫苗，我们首先人工合成了痘苗病毒强启动子PE/L，并构建了含痘苗病毒强启动子转移质粒载体pSCPE/L，与pSCll相比，pSCPE/L不仅具有较强的调控外源基因的表达能力，而且由于在pSCPE/L中引入了多克隆位点，使其在构建重组转移载体时更加方便。我们共获得两株重组痘苗病毒，一株是表达BEFV的主要免疫原性糖蛋白G基因的重组痘苗病毒rVVPE/LG，另一株为同时表达G基因和牛IL-2全基因(sIL-2)的双重组痘苗病毒rVVPE/LGsIL2，并对G蛋白和IL-2在重组病毒中的蛋白表达情况进行了初步研究。主要内容如下： 首先以RT-PGR法扩增并克隆了BEFV中国分离株(JB76H)中的主要免疫原性糖蛋白G基因并进行了脱氧核糖核苷酸序列分析，发现G蛋白基因中存在的T5CT序列对痘苗病毒P7.5启动子具有终止信号的功能。为解决这一问题，本研究人工合成了强启动子PE/L，取代了痘苗病毒转移载体pSCll中的P7.5启动子，构建了新的痘苗病毒转移载体pSCPE/L，将G基因插入PE/L下游，构建了重组痘苗病毒转移载体质粒pSCPE/LG。pSCPE/L的另一启动子P11调控报告基因LacZ的表达，我们用sBoIL-2基因取代LacZ，构建了可同时表达G基因和sBoIL-2基因的另一株重组质粒。将上述2株质粒进行了转染，通过筛选，得到了重组病毒，并对蛋白的表达水平进行了检测。SDS-PAGE结果表明，在PE/L的调控下，重组痘苗病毒成功表达了G蛋白基因，不仅糖基化水平与天然G蛋白相近，而且表达效率很高；在P11启动子调控下，BosIL-2基因也得到了表达。MTT比色法的结果表明，双重组病毒rVVPE/LGsIL2表达的IL-2对Con A活化的PBM具有良好的维持体外生长和繁殖的作用。 兔体免疫实验的结果表明，两种重组痘苗病毒表达的G蛋白诱导兔体产生中和抗硕士学位论文 拓 要2001年11月体的速率和效价均高于传统油苗免疫，证明重组痘苗病毒具有作为牛流行热病毒重组痘苗病毒的潜能。其中双重组病毒rVyP。。GsILZ 的中和抗体水平又高于单重组病毒rVVP。、G。本实验构建的重组痘苗病毒为今后以此为工具，研制BEFV重组痘苗病毒活载体疫苗和探讨几－2对活载体疫苗的免疫增强作用奠定了基础。