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转基因植物给人类带来巨大经济价值的同时也存在生物安全隐患，因此，近年来人们一直探索如何消除转基因植物可能带来的生物安全性问题。已经证实，来源于微生物的位点特异性重组酶系统能有效删除转基因植物中的抗性选择抗性标记基因，现己广泛应用于转基因植物生物安全控制中。前期工作中，本实验室以重组酶系统Cre/loxP与FLP/FRT为基础，构建了一个新的基因删除系统“Gene—deletor”。为了进一步提高该系统的删除效率，本论文在已有研究基础上，重点研究了核定位信号序列(nuclear localization signal，NLS)对重组酶Cre删除效率的影响。为此合成了四种被证实在多数植物中起作用的核定位信号，将它们分别与GFP：：GUS基因融合构建表达载体，通过遗传转化手段将其转入烟草，筛选出入核效率最高的NLS；再将其与重组酶基因Cre融合构建表达载体，遗传转化烟草，初步分析了NLS融合于Cre的N端对其入核及删除效率的影响。主要结果如下：
1．不同类型NLS协助蛋白入核效率比较分析
为了提高重组酶入核的效率，本论文选择四种典型的NLS，分别为：单向的来自SV40大T抗原的SV40NLS；双向的来自玉米转录因子Opaque-2的O2NLS；来自酵母蛋白Mat a-2的rpl25NLS(这个NLS只被importinβ识别)，以及类似Mat a-2NLS的来自玉米转录因子的NLSC。将它们分别与标记基因(GFP：：GUS)融合，构建融合表达载体，并转化烟草，确定获得双功能活性的GFP：GUS融合基因后；比较NLSs介导GFP：：GUS融合蛋白入核的效率。
首先，对叶片上皮细胞GFP荧光的定性观察结果发现，转基因pBI—SV40NLS—GFP：：GUS细胞层的荧光明显集中于细胞核；其他融合了核定位信号的转基因植物细胞与未融合NLS的转基因植物细胞中，荧光信号多呈现弥散分布，没有聚集的相对较强的荧光信号；非转基因植株中未检测到任何荧光信号。
核蛋白GUS酶活定量检测发现：pBI—SV40NLS—GFP：：GUS植株的核内GUS酶活在90-380U之间，明显高于pBI—GFP：：GUS与其他融合NLS的转基因植株，大约是它们的2-4倍。
2．NLS对重组酶效率影响的初步研究
进一步将已合成的SV40NLS融合至重组酶Cre的N端，构建植物表达载体pBI—CaMV35S—Cre—NOS与pBI—CaMV35S—SV40NLS—Cre—NOS。由发根农杆菌介导，二次转化含特异识别位点的GUS阳性烟草pLFGN，获得二次转化的再生发根，GUS染色统计删除效率，分析SV40NLS对重组酶Cre效率的影响。结果发现：Cre的N端融合SV40NLS，对重组酶在烟草中的平均删除水平没有明显的影响，但能够协助其进入与聚集于烟草细胞核，促进重组酶快速删除外源基因。
以上研究表明，我们筛选到的高效的核定位信号SV40NLS，可以提高重组酶蛋白入核效率，从而加快删除反应进行。但要获得真正效率提高的删除系统，还需进一步研究它对其他重组酶的作用。