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目的： 本课题探讨了Curcumin在治疗卵巢癌细胞发生耐药的分子机制。研究自噬的保护作用在Curcumin发生耐药中的关键作用，探讨使用自噬抑制剂是否可以逆转Curcumin在卵巢癌发生耐药的机制。 在本研究中，SK-OV-3和A2780人卵巢癌上皮性细胞株购自ATCC。H0-8910人卵巢癌上皮性细胞系和HEK-293T人胚肾细胞系购自中国科学院（上海）。SK-OV-3和A2780通过转染后经嘌呤霉素筛选构建敲减LC3B的稳定SK-OV-3-pLK0.1-shLC3B和A2780-pLK0.1-shLC3B细胞株，同时建立与之对应的对照细胞株SK-OV-3-pLK0.1-NC和A2780-pLK0.1-NC。 方法： MTT测定法、EdU细胞增殖测定法、细胞集落形成测定法以及流式细胞检测不同浓度Curcumin作用SK-OV-3和A2780在各个时间点的细胞活力。 Curcumin对SK-OV-3和A2780细胞中凋亡相关蛋白表达用Western blot检测。电镜下观察A2780细胞自噬囊泡、荧光显微镜下观察自噬标记LC3免疫荧光检测SK-OV-3和A2780细胞自噬体等方法验证Curcumin处理后的SK-OV-3和A2780细胞系存在自噬作用。应用PI3K抑制剂LY294002以及质粒构建过表达AKT的SK-OV-3细胞系， Curcumin诱导SK-OV-3和A2780细胞发生的自噬保护作用与自噬相关的AKT/mTOR/p70S6K信号通路中靶蛋白分子有相关性由Western blot确认。自噬抑制剂氯喹及shRNA稳定敲除自噬靶点分子LC3B作用后，通过MTT测定法、EdU细胞增殖试验法、流式细胞术及Western blot反向证明Curcumin在SK-OV-3和A2780细胞系上的自噬诱导。 统计软件SPSS23.0分析实验数据，P＜0.05统计学有差异。所有结果均为三次独立性实验所得，结果表示为mean和SD。 结果： 1.Curcumin对SK-OV-3、A2780和H0-8910细胞活力的影响 MTT法检测Curcumin对SK-OV-3、A2780和H0-8910细胞活力的影响:Curcumin(0、5、10、20、40、80μ M)处理24h、48h和72h对SK-OV-3、A2780和H0-8910细胞的生长抑制作用，结果显示Curcumin降低了三种卵巢癌细胞系SK-OV-3、A2780和H0-8910的细胞活力，生长抑制以浓度依赖性和时间依赖性方式表现，差异有统计学意义（P＜0.05)。Curcumin的IC50值:SK-OV-3细胞系在24h、48h和72 h分别为41.05、31.84和30.29μM;A2780细胞系在24h、48h和72h分别为18.37、13.26和13.83μ M;H0-8910细胞系在24h、48h和72h分别为18.93、14.46和13.92μ M。 细胞集落形成实验用于观察Curcumin对EOC细胞增殖的长期抑制。10μ M浓度的Curcumin明显抑制SK-OV-3细胞系的克隆形成能力。EdU细胞增殖试验用于验证Curcumin是否对细胞增殖有直接作用，在SK-OV-3细胞中，用Curcumin处理48h后，EdU的摄取率明显受到抑制且呈浓度依赖性，表明Curcumin对SK-OV-3、A2780和H0-8910卵巢癌细胞系具有杀伤作用。差异均有统计学意义（P＜0.05）。 2.Curcumin对SK-OV-3和A2780卵巢癌细胞凋亡的影响 采用流式细胞仪检测SK-OV-3和A2780细胞凋亡:Curcumin30μ M就可以显著诱导A2780细胞系的细胞凋亡，浓度到达40μM后，能显著诱导SK-OV-3细胞系的细胞凋亡，差异有统计学意义，P＜0.05。 应用Western blot分析Curcumin对Caspase和PARP活性的影响，显示Curcumin激活了Caspase-9和PARP，提示EOC细胞中Caspase活化引起的细胞凋亡与Curcumin诱导的细胞死亡有关联。 3.Curcumin诱导卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780细胞产生自噬现象的机制 电镜观察卵巢癌A2780细胞的超微结构，15μ M的Curcumin处理48h后的卵巢癌A2780细胞，结果表明用Curcumin处理的A2780细胞组与对照A2780细胞组相比存在大量自噬泡。SK-OV-3细胞的免疫荧光染色证实，自噬特异标记物LC3B在Curcumin作用下增加其荧光表达。与对照组相比，40μ M Curcumin作用SK-OV-3细胞48h显示出LC3B荧光形成密度和强度的显著增加，表明Curcumin可诱导SK-OV-3细胞发生自噬。差异有统计学意义（P＜0.05)。 Western blot评估SK-OV-3和A2780自噬相关蛋白的表达。不同浓度Curcumin作用48h后，提取蛋白利用Western blot检测自噬相关靶点分子LC3B、Atg3、Beclin-1、 P62蛋白表达，与对照组相比，Curcumin处理后的LC3B-Ⅱ表达显著增加(差异有统计学意义，P＜0.05)，明显上调Atg3、Beclin-1表达，明显下调P62表达，且均以剂量依赖性表现，表明Curcumin可以诱导卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780产生自噬现象。 4.自噬抑制剂加强Curcumin治疗卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780的敏感性 使用自噬抑制剂探讨Curcumin诱导的自噬在SK-OV-3和A2780中发挥的作用。选用自噬抑制剂中的CQ，通过MTT检测发现与单独应用Curcumin相比，联合应用CQ和Curcumin后，明显降低SK-OV-3和A2780的细胞活力，说明CQ可增强Curcumin诱导的细胞死亡。凋亡检测也证实CQ和Curcumin联合组的凋亡率明显高于独立使用的Curcumin组。采用EdU细胞增殖检测法，验证Curcumin和CQ联合是否对细胞增殖有直接影响，结果显示:与独立使用Curcumin相比，CQ和Curcumin联合显著抑制SK-OV-3的EdU摄取率，说明自噬抑制剂CQ阻断自噬的同时增加了Curcumin诱导的细胞凋亡能力，与Curcumin药物联合应用发挥抗卵巢癌作用。差异是否有统计学意义（P＜0.05）。 5.LC3B在Curcumin诱导的卵巢癌细胞SK-OV-3和A2780自噬中的作用 构建了shRNA稳定敲减LC3B的SK-OV-3和A2780卵巢癌细胞系。Western blot显示，在稳定敲减LC3B的SK-OV-3和A2780细胞系中，相对于NC对照组（无目的基因病毒处理组），Curcumin处理后的LC3B-Ⅱ蛋白显著表达升高，（差异有统计学意义，P＜0.05）。另外，LC3B shRNA对Curcumin介导SK-OV-3和A2780发生细胞凋亡的影响中发现cleavedCaspase-9和cleaved PARP的蛋白表达上调，说明Curcumin处理后的LC3B稳定敲除的SK-OV-3和A2780凋亡率明显高于Curcumin处理的NC对照SK-OV-3和A2780细胞系，也就是说，敲减LC3B增强了Curcumin治疗EOC细胞SK-OV-3和A2780的敏感性。 结论： 1.Curcumin诱导EOC细胞凋亡机制，杀伤EOC细胞而抑制EOC; 2.Curcumin抑制AKT/mTOR/p70S6K通路，诱导卵巢癌细胞产生保护性自噬而发生治疗EOC的耐药; 3.自噬抑制剂CQ可增敏Curcumin的抗EOC细胞作用。 创新性及意义： 1.首次发现了Curcumin联合自噬抑制剂发挥协同抗卵巢癌效应; 2.提出了自噬抑制剂可通过抑制Curcumin诱导的保护性自噬来增强Curcumin抗卵巢癌效应; 3.解决EOC细胞凋亡抵抗和EOC化疗耐药提供了新的方向。 局限性： 1.未进行动物和临床实验，探讨Curcumin对卵巢癌的治疗作用; 2.未能对Curcumin作用的主要靶点分子进行探究。