研究目的近年来,血管性认知障碍(Vascular cognitive impairment, VCI)越来越受到人们的重视,血管性痴呆(Vascular dementia, VD)是其中的类型之一,它在老年期痴呆的分类中占一定的比重。缺血性病变尤其是多发性脑梗塞是VD的主要病理基础,但VD的具体发病机制还在探索中。据临床观察显示VD患者存在血清甲状腺激素(Thyroid hormone, TH)水平异常,而临床并无甲状腺功能低下的表现,多数研究认为此现象属于非甲状腺疾病综合征(Nonthyroidal illness syndrome, NTIS)。众所周知,哺乳动物的中枢神经系统作为甲状腺激素活动的重要靶组织,依赖于甲状腺激素的供应。在啮齿类动物脑发育的关键时期,甲状腺激素的缺乏可影响神经元的迁移,生长,分化,突触的发生,髓鞘的形成及神经胶质细胞的增殖。既往多项研究已证明脑内存在相对独立的甲状腺激素代谢系统,甲状腺激素的生物活性很大程度上取决于与细胞核受体结合的T3的浓度。以前一直认为碘化甲腺氨酸可以直接扩散到细胞内,但近30年甲状腺激素的分子生物学研究表明：甲状腺激素主要通过甲状腺激素转运体进出细胞。有机阴离子转运多肽1C1(Organic anion transporting polypeptidelCl,OATP1C1),单羧酸转运蛋白8(Monocarboxylate transporter8, MCT8)是目前被认为是与甲状腺激素具有高亲和力的转运体。本课题组前期研究应用大鼠双侧颈总动脉永久性结扎术(2-vessel occlusion,2VO)制备慢性脑缺血动物模型,发现2V05周大鼠可发生中枢甲状腺激素水平的异常并同时伴有认知障碍,补充外源性甲状腺激素的慢性脑缺血大鼠的水迷宫成绩明显改善,提示慢性脑缺血大鼠的学习记忆障碍与中枢甲状腺激素水平下降有关,但2VO大鼠中枢甲状腺激素水平下降是否受甲状腺激素转运体OATP1C1与MCT8的调控尚无研究报道。因此本实验观察OATP1C1与MCT8在正常大鼠脑组织中的表达并探讨它们在2VO术后不同缺血时间点基因与蛋白水平的变化规律。研究方法1.实验分组：30只清洁级成年雄性SD大鼠,随机选择其中5只正常大鼠用于免疫荧光,其余25只正常大鼠随机分为正常对照组(normal, n=5),2VO3天组(A,n=5),2V02周组(B,n=5),2V05周组(C,n=5),2V08周组(D,n=5)。2.采用免疫荧光法观察OATP1C1, MCT8在正常大鼠侧脑室中的表达。3.各组大鼠于实验终点采用荧光定量PCR法(Real-time Quantitative PCR)测定脑组织中TH转运体OATP1C1mRNA和MCT8mRNA的表达水平。4.各组大鼠于实验终点采用免疫印迹法(Western blotting)测定脑组织中TH转运体OATP1C1和MCT8的蛋白表达水平。5.数据采用SPSS13.0统计软件进行统计处理。用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析,组间多重比较采用Dunnetts3法,以P<0.05为差异显著性检验界限。研究结果1.免疫荧光法观察到OATP1C1, MCT8在正常大鼠侧脑室的血管内皮细胞膜上表达丰富。2.与正常组相比较,甲状腺激素转运体OATP1C1mRNA水平在2V03天组,2V02周组及2V08周组差异无统计学差异(P=I.000,P=0.604,P=0.448),在2V05周组差异有统计学意义(P=0.011)；与2V03天组比较,OATP1C1mRNA水平在2V02周组及2V08周组差异无统计学意义(P=0.456,P=0.427),在2V05周组有统计学差异(P=0.012)；与2V02周组比较,OATP1C1mRNA水平在2V05周组有统计学意义(P=0.013),在2V08周组差异无统计学意义(P=0.718)；与2V05周组比较,OATP1C1mRNA水平在2V08周组差异无统计学意义(P=0.414)。3.与正常组相比较,甲状腺激素转运体MCT8mRNA水平在2V03天组,2V02周组及2V08周组差异无统计学差异(P=I.000,P=0.984,P=0.052),在2V05周组差异有统计学意义(P=0.046)；与2V03天组比较,MCT8mRNA水平在2V02周组差异无统计学意义(P=0.883),在2V05周及2V08周组差异有统计学意义(P=0.042,P=0.031)；与2V02周组比较,MCT8mRNA水平在2V05周组没有统计学意义(P=0.054),在2V08周组差异无统计学意义(P=0.351)；与2V05周组比较,MCT8mRNA水平在2V08周组差异无统计学意义(P=0.135)4.免疫印迹法检测所示在2V02周组,2V05周组,2V08周组条带均较正常组与2V03天组加深,这表明2VO术后随着大鼠脑组织缺血时间的延长,甲状腺激素转运体OATP1C1和MCT8蛋白在脑组织中的表达增加。研究结论众所周知甲状腺激素的生物活性是由细胞内的T3浓度决定的,近年来研究发现T3进入中枢神经元有两种途径,一种是：1)T4在OATP1C1的参与下通过血脑屏障；2)T4通过不知名的运载体进入神经胶质细胞；3)T4在D2脱碘酶的作用下转化为T3；4)T3通过不知名的运载体从神经胶质细胞中被释放；5)T3被运载体MCT8或另一种载体转运至神经元。另一种途径是：1)T3由转运体MCT8转运通过血脑屏障,再经过MCT8或另一种载体摄取至神经元。人类SLCO1C1基因编码OATP1C1蛋白,OATP1C1蛋白包含712个氨基酸,有12个跨膜区,OATP1C1主要表达在脑组织的血脑屏障和脉络从,主要转运T4、rT3和极少量的T3,与T4有高度的特异性,它是T4进入脑组织的关键转运体,其种属间有显著差异,大鼠、小鼠的表达高于人类。人类MCT8(SLC16A2)基因位于Xql3.2包括6个外显子和5个内含子。成熟的mRNA长约4.4kb,包含2个翻译起始位点(TLSs)。由于TLS不同,人类MCT8基因编码的蛋白有两种：种含有613个氨基酸,另一种是含有539个氨基酸。非灵长类MCT8基因缺乏第1位TLS,但第二位与人类同源。MCT8有12个跨膜区,其N端和C端都位于细胞内。N端富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸残基(简称PEST),539个氨基酸的蛋白N端含有1个PEST;613个氨基酸的蛋白N端含有2个PEST。因此MCT8也称为X连锁含有PEST的转运体(X-linked PEST-containing transporter. XPCT)。MCT8在不同种属、不同组织中广泛分布,如脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、甲状腺、胎盘。MCT8基因突变导致的AHDS综合征(Allan-Herndon-Dudley syndrome)一类伴有血清T3水平升高的X连锁精神运动性迟缓综合症——使得MCT8在脑发育中的作用日益受到重视。目前认为甲状腺激素转运体MCT8是最具特异性的T3转运体。本实验采用免疫荧光法观察到中枢甲状腺激素转运体OATP1C1,MCT8均丰富地表达于正常大鼠大脑侧脑室的毛细血管内皮细胞膜上,这与之前的研究一致。OATP1C1与MCT8在成年大鼠脉络丛中的高度表达,提示它们在血脑屏障或血脑脊液屏障转运甲状腺激素中发挥着重要作用。本课题组前期研究发现慢性脑缺血(2V05周)成年大鼠发生认知障碍,同时脑组织T3、T4浓度下降,而在急性期及慢性期补充外源性甲状腺激素的2VO大鼠学习记忆能力均明显改善,提示慢性脑缺血大鼠的学习记忆障碍与中枢甲状腺激素水平下降有关,但是2VO大鼠中枢甲状腺激素水平下降是否受甲状腺激素转运体OATP1C1与MCT8的调控尚无研究报道,本实验采用荧光定量PCR法检测OATP1C1与MCT8在不同缺血时间点的大鼠大脑中基因水平的表达,发现随着缺血时间的延长OATP1C1, MCT8基因水平呈不同程度的代偿性增加的趋势,并在缺血5周时达高峰,这表明大鼠在脑缺血5周时脑组织对甲状腺激素的需求显著增加,与我们前期观察到的2V05周大鼠脑组织T3、T4浓度下降相对应,说明OATP1C1与MCT8在转运甲状腺激素通过血脑屏障及血脉络丛屏障进入中枢神经系统、及时补充及代偿中枢缺失的甲状腺激素方面发挥着非常重要的作用。本实验采用Western blotting法检测OATP1C1与MCT8在在不同缺血时间点的大鼠大脑中蛋白水平的表达,发现随着缺血时间的延长OATP1C1与MCT8蛋白水平呈不同程度的代偿性增加的趋势,此结果与基因水平的变化基本一致。尽管随着缺血时间的延长OATP1C1与MCT8基因水平与蛋白呈不同程度的代偿性增加的趋势,但依然不足以代偿缺血大鼠脑组织中减少的甲状腺激素,原因可能有以下几点：1.随着脑组织缺血时间的延长,大鼠的血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)和脉络膜-脑脊液屏障(Choroid Plexus-Cerebrospinal fluid barrier, CP-CSFB)产生不同程度的损伤,因而影响BBB和CP-CSFB上皮细胞内的OATP1C1与MCT8的代偿能力；2.是否脑缺血时中枢神经系统甲状腺激素的代谢过程还存在着其它环节的异常,这有待更进一步的研究。总之,从本实验中,我们看到,中枢甲状腺激素转运体OATP1C1,MCT8都丰富地表达于大脑侧脑室脉络丛的毛细血管内皮细胞膜上,这提示它们在血脑屏障或血脑脊液屏障转运甲状腺激素中发挥着重要作用。随着缺血时间的延长OATP1C1与MCT8基因水平与蛋白呈不同程度的代偿性增加的趋势,虽然不足以代偿缺血大鼠脑组织对甲状腺激素的需求,但是间接反映了脑缺血后脑组织T3,T4水平下降,因而脑缺血大鼠脑组织对TH转运体的需求增加。