【摘 要】
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本文主要从以下几部分展开论述: 第一部分 AEG-1 siRNA干扰序列的筛选及效果验证 目的:设计合成针对人AEG-1基因的三对siRNA序列,验证并从中筛选出对非小细胞肺癌细胞基
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本文主要从以下几部分展开论述: 第一部分 AEG-1 siRNA干扰序列的筛选及效果验证 目的:设计合成针对人AEG-1基因的三对siRNA序列,验证并从中筛选出对非小细胞肺癌细胞基因沉默效果最优的序列。方法:(1)根据RNA干扰原理,针对人AEG-1基因设计并化学合成三对AEG-1 siRNA序列、一对阴性序列和一对带荧光标记的阴性序列(FAM-siRNA)。(2)用脂质体转染试剂lipofetamin2000介导标记的阴性对照序列(FAM-siRNA)转染非小细胞肺癌细胞,转染6小时后,通过荧光显微镜和流式细胞检测技术评价转染效率,进行转染条件的优化。(3)筛选实验分为空白对照组、转染试剂对照组(MOCK组)、阴性对照组以及三个siRNA干扰实验组,转染48小时后。通过荧光定量PCR和Western blot分别观察转染前后非小细胞肺癌A549细胞中AEG-1 mRNA和相应蛋白表达的下调情况。从中选出一对最有效的AEG-1 siRNA序列。结果:荧光定量PCR检测mRNA及Western blot检测蛋白表达结果显示,转染48小时后,三对siRNA均能显著下调非小细肺癌细胞细胞AEG-1基因的mRNA转录和蛋白表达水平,其mRNA表达抑制率分别为69.8%、69.6%和41.4%。三个序列中AEG-1siRNA1的沉默效果最优。结论:成功设计和合成了针对AEG-1基因的小干扰RNA序列,且AEG-1 siRNA1转染细胞后,其mRNA和蛋白表达抑制效果较优,为进一步实验奠定了基础。 第二部分 AEG-1表达下调对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响 目的:采用脂质体转染法介导siRNA靶向沉默非小细胞肺癌细胞AEG-1基因表达,探讨其对细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法:实验分为转染试剂对照(MOCK)组、阴性对照(control siRNA)组及AEG-1 siRNA1干扰实验组。用脂质体lipofetamin2000转染试剂介导AEG-1 siRNA1转染非小细胞肺癌细胞,靶向沉默非小细胞肺癌细胞的AEG-1基因后,用CCK-8细胞增殖实验测定转染一定时间后的细胞增殖情况,运用流式细胞检测技术分析转染48小时后的细胞凋亡情况,同时采用Transwell小室来观察靶向沉默AEG-1基因后,肿瘤细胞的迁移和侵袭能力的变化。结果:转染48小时后,非小细胞肺癌细胞在siRNA干扰实验组中的细胞增殖率较阴性对照组显著下降26.3%,而MOCK组与阴性对照组相比无明显差异。同时,流式细胞检测技术分析结果显示靶向沉默AEG-1表达后,非小细胞肺癌细胞凋亡率升高,而Transwell小室迁移和侵袭结果也表明,转染24小时后,细胞迁移及侵袭能力分别抑制49.3%和54.8%。结论:下调AEG-1基因表达可明显抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和诱导细胞凋亡,且AEG-1与细胞的迁移和侵袭能力密切相关。
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