目的：制天南星为天南星干燥根茎与生姜和白矾加工处理后得到的炮制品,具有燥湿化痰、祛风定惊、消肿散结等功效,临床上多用于久治无效的“顽痹疑难之症”,尤其是对类风湿性关节炎的治疗效果明显。目前天南星毒性物质基础及炮制减毒机理研究已较为透彻,但由于其活性成分尚未研究清楚,导致其炮制机理研究只是阐明“减毒”,而“增/存效”至今仍未有所突破。因此我们选择制天南星临床常用功效——抗类风湿性关节炎进行研究,通过对制天南星化学成分进行分离筛选,探讨制天南星抗类风湿性关节炎物质基础和作用机制,并对活性成分体内吸收排泄进行初步研究,以期为天南星炮制“增/存效”的机理研究提供基础,同时期望通过本研究阐明制天南星抗类风湿性关节炎的物质基础和作用机制,为制天南星的临床应用和制剂开发提供科学依据。方法：1制天南星提取物体内抗类风湿性关节炎作用研究。建立Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎大鼠(CIA)模型,以足趾肿胀程度、关节炎指数、大鼠体重、免疫器官指数、血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-a水平为指标,考察制天南星提取物(100,200,400 mg/kg)在体内抗类风湿性关节炎的药效作用。2制天南星提取部位分离与活性筛选。采用膜分离技术将制天南星提取物按分子量大小(Mw：5000)分为大分子物质组分与小分子物质组分。以抑制脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞Raw264.7炎症反应和抑制CD4+T细胞的存活为指标,分别考察制天南星提取部位对成功造模的炎症模型细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量的影响和对CD4+T细胞活性的影响,筛选制天南星的活性部位。3制天南星化学成分分离与活性筛选。将制天南星大分子物质分为多糖部分和非多糖部分,对多糖部分采用DEAE-52和Sephadex柱层析进一步分离纯化,得到均一多糖;通过抗炎活性和对CD4+T细胞活性的影响进一步筛选制天南星活性成分。4制天南星多糖抗炎机制初探。采用Western blotting检测制天南星中性均一多糖ARPA对LPS诱导的RAW264.7细胞MAPK和NF-κB信号通路中p38、JNK、ERK1/2、IκB、NF-κB p65蛋白表达的变化情况。5制天南星多糖免疫调节机制初探。采用Hoechest 33258和PI染色观察制天南星中性均一多糖ARPA对Jurkat细胞形态的影响；采用流式细胞术检测ARPA对Jurkat细胞周期和凋亡率的影响;采用Western blotting检测ARPA对Jurkat细胞凋亡通路Caspase8、Caspase 9、Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白表达。6制天南星多糖抗类风湿性关节炎作用研究。建立完全弗氏佐剂诱导关节炎大鼠(AA)模型,以足趾肿胀程度、关节炎指数、大鼠体重、免疫器官指数、血清炎症因子水平和组织病理学变化作为评价指标,考察制天南星中性均一多糖ARPA (20,40,60mg/kg)体内抗类风湿性关节炎的药效作用。7制天南星多糖药代动力学初步研究。采用异硫氰酸荧光素标记ARPA,检测标记物在生物样品中的稳定性。建立荧光素标记ARPA的定量检测方法；采用荧光分光光度法测定大鼠灌胃ARPA的实时血药浓度,计算药动学参数；并研究药物在大鼠体内的排泄情况。8天南星炮制前后中性均一多糖ARPA的含量变化。通过优化制天南星中性均一多糖的制备工艺,制备同一批次的生天南星和制天南星中性均一多糖,并与ARPA的性质进行比较。同时测定生品和炮制品ARPA的含量。结果：1制天南星提取物在400 mg/kg和200 mg/kg的剂量对CIA大鼠的足肿胀和全身症状具有明显的改善作用；能降低CIA大鼠脾脏指数；抑制大鼠外周血中促炎性因子TNF-α、L-1β和IL-6的水平,同时增加抑炎性因子IL-10的水平。2制天南星大分子物质组分有一定的抗炎活性和抑制CD4+T细胞的活性；小分子物质组分几乎未对CD4+T细胞的活性产生影响,并且在低浓度表现出促进炎症发展趋势。3从制天南星总多糖中得到6个均一多糖,分别为ARPA、ARPB、ARPC-Ⅰ、ARPC-Ⅱ、ARPD和ARPE。其中抗炎活性最好的是ARPA和ARPB,抑制CD4+T细胞的活性最强的是ARPA和ARPC-Ⅱ。4制天南星多糖潜在的抗炎机制。ARPA可能通过抑制IκB的降解调控NF-κBp65的结合和释放,影响炎症因子的合成；同时可能通过抑制MAPK通路中的p38和ERK1/2的磷酸化,继而影响下游核转录因子的激活。ARPA对于磷酸化的JNK表达不但没有下调,反而大幅上调。5制天南星多糖潜在的免疫调节机制。ARPA可以使Jurkat细胞停滞在G2/M期,阻滞Jurkat细胞的分裂,导致细胞增殖受抑制,同时诱导Jurkat细胞发生凋亡。ARPA诱导Jurkat细胞发生凋亡是通过Caspase-3和Caspase-9,而不是Caspase-8,进一步研究细胞凋亡的线粒体途径,ARPA能显著上调促凋亡蛋白Bax的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。6制天南星多糖抗类风湿性关节炎药效研究。ARPA在60mg/kg的剂量可使AA大鼠足趾肿胀程度显著下降；改善AA大鼠的全身评分,能降低AA大鼠胸腺指数,但对脾脏指数无显著影响,血清炎症因子水平表明ARPA对AA大鼠起到一定的抗炎作用,关节滑膜组织切片结果显示大鼠在给予60mg/kg的ARPA治疗后,免疫细胞数量和炎性浸润都明显减少。7制天南星多糖的药动学初步研究。ARPA通过与酪胺结合,再结合FITC实现荧光标记。完成标记后的ARPA-Tyr-Fitc体外在PBS溶液、血浆和尿液都有较好的稳定性；体内大鼠口服给药后血浆、尿液和粪便中ARPA均以原型形式存在。大鼠灌胃ARPA-Tyr-Fitc剂量100mg/kg在48h的药动学和体内排泄情况表明口服ARPA-Tyr-Fitc在体内有少量以原形药物吸收入血,主要以药物原形通过粪便排出体外。8天南星炮制前后ARPA的含量变化。通过优化的工艺可以稳定的制备ARPA,且ARPA在生品的含量高于炮制品1.4倍。结论：均一多糖A是制天南星发挥抗类风湿性关节炎作用的物质基础之一,均一多糖A口服后在大鼠体内少部分吸收入血,主要以原形药物的形式通过粪便排出体外。其作用机制与调节MAPK/NF-κB炎症信号通路改善RA的外在炎症症状,通过线粒体途径诱导CD4+T细胞发生凋亡相关。均一多糖A同时存在于生天南星和制天南星,炮制过程会造成均一多糖A含量约28%的损失。