1研究背景由于环境的污染,人们生活方式的改变,恶性肿瘤已成为威胁人类生命和健康的一大杀手。近年来,关于抗肿瘤治疗的研究一直在不断发展和进步,但依旧没有取得突破性进展,攻克恶性肿瘤仍然是人类面临的一大科学难题。中医中药治疗肿瘤因其整体性、多靶点、高效低毒的特征有着良好的效果,因此从祖国传统医学中发掘具有显著抗肿瘤作用的中药及中药复方,已成为国内外抗肿瘤领域研究的一个重要思路。安替可胶囊由蟾皮和当归二味中药材配伍组成,大量实践表明,其对恶性肿瘤的临床治疗具有明显的疗效。然而,安替可胶囊与其它中药复方一样,存在着功效成分不清楚、作用机制不明确的缺陷,制约着安替可胶囊的广泛应用以及在国际上的认可。因此,对安替可胶囊进行全面系统的成分分析,阐明安替可胶囊发挥抗肿瘤作用的药效物质基础、作用机制和组方原理,进而从中筛选出成分清楚、靶点确切、配伍合理、疗效显著的化学成分组方,不仅对于其二次开发有着重要的意义,更是实现中药现代化、国际化的迫切需要。本研究基于此目的,采用中药指纹图谱、血清药物化学和药代动力学等研究手段,检测安替可胶囊中主要化学成分及其入血移行成分、安替可胶囊及其主成分抗肿瘤活性等,藉此阐明安替可胶囊组方的科学性和合理性。2方法2.1安替可胶囊的成分分析和质量控制:利用高效液相色谱法建立安替可胶囊的指纹图谱和多成分含量测定的分析方法,在此基础上,对色谱图中安替可胶囊的特征色谱峰进行筛选,并结合已知对照品对特征色谱峰进行化学鉴定和含量测定。色谱条件:Angilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6×250 mm,5μm),Angilent Zorbax SB-C184.6×12.5 mm保护住,柱温:30℃;流动相采用乙腈(A)和0.1%冰醋酸-0.5%磷酸二氢钾水溶液(磷酸调节p H=2.4)(B)梯度洗脱的方法,时间程序为:8%乙腈(0min),30%乙腈(20 min),40%乙腈(45 min),50%乙腈(70 min),40%乙腈(75 min),和8%乙腈(80 min),流速0.8 m L/min;进样量:20μL,检测波长:296 nm。2.2安替可胶囊血中移行成分分析:利用甲醇加热回流提取后浓缩,真空冷冻干燥器挥干其中水分的方法,制备安替可胶囊、蟾皮药材和当归药材提取物的冻干粉;采用血清药物化学的研究手段和安替可胶囊指纹图谱的色谱条件,分析安替可胶囊冻干粉经灌胃给药后大鼠血清的高效液相色谱图,并与安替可胶囊冻干粉指纹图谱、已知对照品色谱图、空白血清色谱图相比较,鉴定安替可胶囊冻干粉的入血成分。2.3蟾皮、当归及其配伍在大鼠体内的药代动力学研究:利用高效液相色谱技术,建立同时测定大鼠血浆中阿魏酸、洋川芎内酯I、远华蟾毒精和蟾毒灵4种成分血药浓度的分析方法,色谱条件为Angilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6×250 mm,5μm),Angilent Zorbax SB-C18 4.6×12.5 mm保护住,流动相采用乙腈(A)和0.1%冰醋酸-0.5%磷酸二氢钾水溶液(磷酸调节p H=2.4)(B)梯度洗脱的方法,时间程序为:10%乙腈(0 min),20%乙腈(6 min),40%乙腈(40 min),50%乙腈(50 min),30%乙腈(55 min),和10%乙腈(60 min),流速0.8 m L/min,柱温:30℃,进样量:20μL,检测波长:296 nm;由此分别绘制了4种成分分别在蟾皮单味、当归单味和蟾皮当归配伍给药条件下的血药浓度-时间曲线,比较三组之间4种血中移行成分的药代动力学参数的差异,探讨药物配伍使用后对主要活性成分药代动力学规律的影响。2.4蟾毒灵配伍阿魏酸体外抗肿瘤的实验研究:利用MTT法,分析蟾毒灵和阿魏酸对人源性肝癌细胞株Hep G2、HCCLM3、Hep-3B、Bel-7404和QGY-7703的细胞毒作用并分别计算半数抑制浓度(IC50);以Chou-Talalay联合指数法分析蟾毒灵和阿魏酸配伍应用对五种肝癌细胞株的药物联合作用指数(CI);利用流式细胞技术分析蟾毒灵、阿魏酸及其配伍使用,对肝癌细胞株Hep G2细胞周期分布的影响。3结果3.1安替可胶囊的成分分析和质量控制:色谱图中筛选出28个共有色谱峰为安替可胶囊的特征色谱峰,其中16个色谱峰经过鉴定分别对应:阿魏酸、日蟾毒它灵、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰化蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、阿魏酸松柏酯、华蟾酥毒基、洋川芎内酯A、脂蟾毒配基、蒿本内酯和正丁烯基苯酞。建立了同时测定安替可胶囊中16种成分含量的方法,该方法稳定可行、精密度高、重复性好,各成分回收率在94.86~103.10%范围内,适用于安替可胶囊的质量控制。3.2安替可胶囊血中移行成分分析:大鼠灌胃给予安替可胶囊冻干粉后,从血清中鉴定出9个移行成分,并确证了其中4个成分的化学结构,分别归属于当归的阿魏酸、洋川芎内酯I和蟾皮的远华蟾毒精、蟾毒灵;由此推测阿魏酸、洋川芎内酯I、远华蟾毒精和蟾毒灵4种成分可能为安替可胶囊发挥抗肿瘤药效的主要活性成分。3.3蟾皮、当归及其配伍在大鼠体内的药代动力学研究:蟾皮配伍当归给药与当归单味给药两组相比,阿魏酸和洋川芎内酯I的药物达峰浓度,药时曲线下面积明显提高(P﹤0.05),平均滞留时间,血浆清除率,表观分布容积显著降低(P﹤0.05);蟾皮配伍当归给药与蟾皮单味给药组相比,远华蟾毒精和蟾毒灵的药物达峰浓度,药时曲线下面积明显减小(P﹤0.05),而平均滞留时间,血浆清除率,表观分布容积显著升高(P﹤0.05);提示蟾皮和当归配伍给药能够有效促进阿魏酸和洋川芎内酯I在大鼠血中的吸收,降低药物血浆清除率,提高生物利用度,同时能够有效延长远华蟾毒精和蟾毒灵的作用时间并促进药物向组织分布。3.4蟾毒灵配伍阿魏酸体外抗肿瘤的实验研究:MTT结果显示,蟾毒灵细胞毒性显著并呈明显的量-效依赖关系,对五种肝癌细胞株的半数抑制浓度分别为57.60、83.13、74.16、27.47、52.31μM;阿魏酸细胞毒性较弱,其对五种肝癌细胞株的半数抑制浓度分别为1.98、1.89、3.20、0.97、1.16 m M;Chou-Talalay法分析结果发现,蟾毒灵和阿魏酸配伍作用于五种肝癌细胞株,在大多数合用情况下联合用药指数CI大于1.0,两药联用时互相拮抗;流式细胞技术分析结果显示,蟾毒灵单用能够将Hep G2细胞阻滞于G2/M期(P﹤0.05),阿魏酸对Hep G2细胞分裂G1/G0期和S期无明显影响,两药配伍使用,其G2/M期阻滞作用比蟾毒灵单用更强(P﹤0.05)。4结论首次建立安替可胶囊HPLC指纹图谱,确证其中28个共有色谱峰并归属其中16种成分;利用血清药物化学方法发现安替可胶囊9个入血移行成分,并归属了4个成分的化学结构即来自于当归的阿魏酸、洋川芎内酯I和来自蟾皮的远华蟾毒精、蟾毒灵;揭示了这4种成分的体内药代动力学特征;同时探讨了蟾毒灵和阿魏酸配伍对肿瘤细胞的联合用药效果和细胞周期分布影响,为进一步阐明组方的科学性合理性提供了思路,也为开发创制安替可胶囊的分子中药提供了参考。