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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是一种急性、热性、高度接触性的传染病,该病是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的。VP2蛋白是IBDV的主要保护性抗原,与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异、细胞凋亡等有关,而多聚蛋白(VP2/4/3)可正确剪切成具有天然构型的VP2蛋白。因此,选择合适的目的基因尤为重要。本课题利用杆状病毒载体表达vp2基因和vp2/4/3基因,通过Bac-to-Bac系统获得重组BacmidDNA,将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒;并将带有CMV启动子和VSVGED、WPRE、ITRs等不同调控元件的假型杆状病毒与未经改造的杆状病毒分别作为基因转移载体,通过SDS-PAGE和Western blotting分析比较外源基因在禽类细胞中的表达时间和表达水平;同时利用获得的重组杆状病毒直接作为疫苗进行免疫,将外源抗原基因高效地传递到家禽细胞中,使其有效地刺激机体产生特异性保护抗体和较强的细胞免疫应答,筛选确定主要保护性抗原蛋白基因,比较分析带有不同调控元件的重组杆状病毒的表达效果及免疫效果的区别,该研究将为利用杆状病毒开发禽类疫苗奠定基础。以GenBank上已发表的IBDV-VP2和IBDV-VP2/4/3序列为参考序列,应用Primer 5软件设计特异性引物,将His标签基因序列融合于vp2基因和vp2/4/3基因的5’端,通过PCR方法,扩增His-VP2基因和His-VP2/4/3基因,并分别将其克隆到pMD18-T载体上,经酶切以及序列测定结果分析,证明获得了含有His-VP2融合基因和His-VP2/4/3融合基因的阳性重组质粒pT-VP2和pT-VP2/4/3。将His-VP2基因和His-VP2/4/3基因亚克隆至转移载体pS、pS-ITRs、pS-con中,经组合酶切鉴定,证明成功获得了重组转移载体pS-VP2、pS-ITRs-VP2、pS-con-VP2、pS-VP2/4/3、pS-ITRs-VP2/4/3 和 pS-con-VP2/4/3,将这些转移载体分别转化至E.coli DH10 Bac感受态细胞中,通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得重组穿梭质粒rBac-S-VP2、rBac-S-ITRs-VP2、rBac-S-con-VP2、rBac-S-VP2/4/3、rBac-S-ITRs-VP2/4/3 和 rBac-S-con-VP2/4/3,将这些穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒P1代储备,复扩病毒至P3代,空斑法分析病毒的滴度均在1.5 × 108pfu/mL左右。将获得的6个重组杆状病毒分别侵染鸡原代细胞,利用SDS-PAGE和Western-blotting成功检测到VP2蛋白的表达。其中BV-S-VP2、BV-S-ITRs-VP2的蛋白表达量为BV-S-con-VP2 的 2.5 倍和 2.4 倍;BV-S-VP2/4/3、BV-S-ITRs-VP2/4/3 的蛋白表达量为BV-S-con-VP2/4/3的2.4倍和2.2倍。以6个重组杆状病毒和商品化疫苗作为试验组,并设置阳性、阴性对照组,分别免疫接种SPF鸡(14日龄),所有试验鸡分别于第14、21、28、35、42日龄翅下静脉取血,分离血清后,利用血清中和试验和ELISA法检测血清抗体水平,并比较分析不同抗原蛋白的免疫原性。结果显示:VP2/4/3系列的重组杆状病毒血清的抗体水平显著高于空白组和空载体组(P<0.05),其中血清中和试验中VP2/4/3系列抗体效价最高可达1:2885.42,明显高于疫苗组的1:1326.68和攻毒对照组的1:8.32;ELISA检测VP2/4/3系列抗体水平在第42天可达到1.225,高于疫苗组的1.125和攻毒对照组的0.249。攻毒试验结果表明:VP2系列和VP2/4/3系列保护率分别为95.8%和100%,高于疫苗组87.5%的保护率,与对照组50%的保护率差异显著。本研究将为下一步开发防治禽类新型疫苗奠定理论和实践基础,同时也为防治其他病毒性疾病的非复制型活疫苗开发提供崭新思路和有益借鉴。