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目的:探讨90mmol/L葡萄糖刺激大鼠腹膜间皮细胞后,VEGF及其受体核酸水平的时间变化曲线;探讨不同浓度葡萄糖刺激下,大鼠腹膜间皮细胞VEGF及其受体表达的变化。
方法:分离、培养SD雄性大鼠腹膜问皮细胞,常规传代及鉴定,第二代细胞用于实验研究。90mmol/L葡萄糖作用于细胞,RT—PCR检测不同时间点(0,0.5h,2h,8h,12h,24h,48h) VEGF及其受体VEGFR1、VEGFR2及sFlt-1 mRNA水平的变化;分别用30mmol/L(低糖组)、60mmol/L(中糖组)、90mmol/L葡萄糖(高糖组)刺激大鼠腹膜间皮细胞,90mmol/L甘露醇作渗透压对照(甘露醇组),DMEM低糖培养基做对照(对照组),刺激24小时,以RT—PCR检测核酸水平的变化;ELISA检测细胞培养上清中VEGF、sFlt-1蛋白质表达水平,WesternBlot检测VEGFR1、VEGFR2的蛋白质变化。
结果:①培养的大鼠腹膜间皮细胞融合后,具有典型的鹅卵石状或铺路石样上皮细胞形态。传代后用抗大鼠Keratin、抗Vimentin抗体检测相关抗原,结果显示细胞抗大鼠Keratin、Vimentin表达阳性;②常规培养的大鼠腹膜间皮细胞在核酸水平表达VEGF及受体VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1。90mmol/L葡萄糖刺激后,VEGF和VEGFR2 mRNA表达水平下降,以12小时为最低;sFlt-1和VEGFR1 mRNA呈现先升高、降低后升高的趋势,在24小时到达高峰;③低糖组VEGFmRNA的表达显著高于对照组(p<0.05),而高糖组VEGFmRNA的表达显著低于对照组(p<0.05),中糖组和甘露醇组VEGF mRNA表达与对照组相比无差异(p均>0.05);④低糖组、中糖组、高糖组VEGFR1mRNA表达均显著高于对照组(p均<0.01),高糖组显著高于中糖组及其他各组(p均<0.01),葡萄糖刺激RPMCs上调VEGFR1mRNA表达,呈浓度依赖的趋势;⑤中糖组、高糖组sFlt-1mRNA表达均高于对照组(p均<0.05),低糖组与对照组无差异(p>0.05),葡萄糖刺激RPMCs上调sFlt-1mRNA表达,呈浓度依赖的趋势:⑥中糖组、高糖组VEGFR2 mRNA表达显著低于对照组(p均<0.01),葡萄糖下调RPMCs VEGFR2 mRNA表达,呈浓度依赖的趋势;⑦ELISA结果显示,低糖组VEGF的表达高于对照组(p<0.05),而高糖组VEGF的表达低于对照组(P<0.05);中糖组、高糖组sFlt-1表达均高于对照组(p均<0.05),低糖组与对照组无差异(p>0.05);⑧Western Blot结果显示,低糖组、中糖组、高糖组VEGFR1表达均显著高于对照组(p均<0.01),高糖组显著高于中糖组及其他各组(p均<0.01),葡萄糖刺激RPMCs上调VEGFR1蛋白表达,呈浓度依赖的趋势;中糖组、高糖组VEGFR2表达均低于对照组(p均<0.01),高糖组表达低于低糖组和中糖组(p均<0.05)。葡萄糖下调RPMCs VEGFR2蛋白表达,呈浓度依赖的趋势。
结论:90mmol/L葡萄糖刺激后,VEGF和VEGFR2 mRNA表达下降;sFlt-1和VEGFR1 mRNA呈现先升高后降低的趋势,24小时为表达高峰;葡萄糖上调VEGFR1和sFlt-1核酸和蛋白质水平的表达,呈浓度依赖趋势,同时下调VEGFR2的表达;低糖刺激可上调VEGF的表达,高糖刺激时VEGF表达下降;葡萄糖不仅可调节体外培养大鼠腹膜间皮细胞VEGF的表达,同样可以调节其受体VEGFR1、sFlt-1、VEGFR2核酸及蛋白质水平的表达,从而达到调节VEGF系统的作用。