葡萄糖对大鼠腹膜间皮细胞血管内皮生长因子及其受体表达影响的研究

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目的:探讨90mmol/L葡萄糖刺激大鼠腹膜间皮细胞后,VEGF及其受体核酸水平的时间变化曲线;探讨不同浓度葡萄糖刺激下,大鼠腹膜间皮细胞VEGF及其受体表达的变化。 方法:分离、培养SD雄性大鼠腹膜问皮细胞,常规传代及鉴定,第二代细胞用于实验研究。90mmol/L葡萄糖作用于细胞,RT—PCR检测不同时间点(0,0.5h,2h,8h,12h,24h,48h) VEGF及其受体VEGFR1、VEGFR2及sFlt-1 mRNA水平的变化;分别用30mmol/L(低糖组)、60mmol/L(中糖组)、90mmol/L葡萄糖(高糖组)刺激大鼠腹膜间皮细胞,90mmol/L甘露醇作渗透压对照(甘露醇组),DMEM低糖培养基做对照(对照组),刺激24小时,以RT—PCR检测核酸水平的变化;ELISA检测细胞培养上清中VEGF、sFlt-1蛋白质表达水平,WesternBlot检测VEGFR1、VEGFR2的蛋白质变化。 结果:①培养的大鼠腹膜间皮细胞融合后,具有典型的鹅卵石状或铺路石样上皮细胞形态。传代后用抗大鼠Keratin、抗Vimentin抗体检测相关抗原,结果显示细胞抗大鼠Keratin、Vimentin表达阳性;②常规培养的大鼠腹膜间皮细胞在核酸水平表达VEGF及受体VEGFR1、VEGFR2、sFlt-1。90mmol/L葡萄糖刺激后,VEGF和VEGFR2 mRNA表达水平下降,以12小时为最低;sFlt-1和VEGFR1 mRNA呈现先升高、降低后升高的趋势,在24小时到达高峰;③低糖组VEGFmRNA的表达显著高于对照组(p<0.05),而高糖组VEGFmRNA的表达显著低于对照组(p<0.05),中糖组和甘露醇组VEGF mRNA表达与对照组相比无差异(p均>0.05);④低糖组、中糖组、高糖组VEGFR1mRNA表达均显著高于对照组(p均<0.01),高糖组显著高于中糖组及其他各组(p均<0.01),葡萄糖刺激RPMCs上调VEGFR1mRNA表达,呈浓度依赖的趋势;⑤中糖组、高糖组sFlt-1mRNA表达均高于对照组(p均<0.05),低糖组与对照组无差异(p>0.05),葡萄糖刺激RPMCs上调sFlt-1mRNA表达,呈浓度依赖的趋势:⑥中糖组、高糖组VEGFR2 mRNA表达显著低于对照组(p均<0.01),葡萄糖下调RPMCs VEGFR2 mRNA表达,呈浓度依赖的趋势;⑦ELISA结果显示,低糖组VEGF的表达高于对照组(p<0.05),而高糖组VEGF的表达低于对照组(P<0.05);中糖组、高糖组sFlt-1表达均高于对照组(p均<0.05),低糖组与对照组无差异(p>0.05);⑧Western Blot结果显示,低糖组、中糖组、高糖组VEGFR1表达均显著高于对照组(p均<0.01),高糖组显著高于中糖组及其他各组(p均<0.01),葡萄糖刺激RPMCs上调VEGFR1蛋白表达,呈浓度依赖的趋势;中糖组、高糖组VEGFR2表达均低于对照组(p均<0.01),高糖组表达低于低糖组和中糖组(p均<0.05)。葡萄糖下调RPMCs VEGFR2蛋白表达,呈浓度依赖的趋势。 结论:90mmol/L葡萄糖刺激后,VEGF和VEGFR2 mRNA表达下降;sFlt-1和VEGFR1 mRNA呈现先升高后降低的趋势,24小时为表达高峰;葡萄糖上调VEGFR1和sFlt-1核酸和蛋白质水平的表达,呈浓度依赖趋势,同时下调VEGFR2的表达;低糖刺激可上调VEGF的表达,高糖刺激时VEGF表达下降;葡萄糖不仅可调节体外培养大鼠腹膜间皮细胞VEGF的表达,同样可以调节其受体VEGFR1、sFlt-1、VEGFR2核酸及蛋白质水平的表达,从而达到调节VEGF系统的作用。
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