论文部分内容阅读
玫瑰(Rosarugosa)在我国栽培历史悠久,是享誉盛名的天然香料植物,其鲜花可提取玫瑰精油、制作玫瑰花茶、鲜花饼等,广泛应用香料、化妆品和食品等行业。当前玫瑰产业已形成了从栽培到精深加工及产品开发的完整产业链,经济效益十分可观。作为一种以采摘花朵为主的经济植物,玫瑰的分枝习性决定了其侧枝的生长发育和数量,也是影响其鲜花生物产量的重要因素。因此,挖掘调控玫瑰侧枝发生的关键基因并阐明其内在调控机理,不仅可以丰富植物侧枝发育的相关理论,还可为今后通过基因工程手段调整玫瑰株型、培育多分枝高产玫瑰新品种奠定坚实的理论基础。本文以‘紫枝玫瑰’(Rosa rugosa ’Zizhi’)为试材,利用转录组测序和基因表达谱技术,挖掘并筛选出了与玫瑰侧枝发育相关的转录因子基因,并对关键转录因子RrRAX3进行了克隆和表达特性分析;测定了不同侧枝中植物激素的含量,并分析了RrRAX3表达量与侧枝发育及激素含量之间的关系;进一步构建了RrRAX3基因的CRISPR/Cas9载体和过表达载体,同源转化玫瑰,验证RrRAX3调控玫瑰侧枝发育的功能,主要研究结果如下:1.以‘紫枝玫瑰’一、二、三级侧枝为试验材料,通过转录组测序,建立了 59052个基因组成的玫瑰侧枝表达谱,高丰度基因分析表明,玫瑰侧枝发育涉及活跃的结构构建和功能调控过程。通过差异表达分析,筛选出1789个差异表达基因。富集分析发现,玫瑰侧枝中碳水化合物代谢、叶绿体(叶绿素)合成活动活跃,尤其以生长素、赤霉素和油菜素内酯为代表的植物激素信号转导通路显著激活,综合复杂的蛋白互作关系,暗示着玫瑰的侧枝形成发育中涉及到复杂的代谢调控过程。2.筛选出了 18个与玫瑰侧枝发育相关的候选转录因子,包括7个WRKY,5个ERF,3个bHLH以及RAX3、TCP18和WIN1各1个成员。综合考虑同源性高低、表达丰度、上下调倍数以及同源基因对应的功能机制,选择RAX3基因(Unigene25215)作为本文后续深入研究的目的基因。3.对玫瑰RrRAX3基因进行全长克隆并分析了其表达特性,同时测定了‘紫枝玫瑰’一、二、三级侧枝中植物激素的含量。结果发现,玫瑰RrRAX3基因包含典型的R2R3-MYB蛋白结构域和核定位信号,且和月季(Rosa chinensis)的RAX3基因高度同源。RrRAX3基因表达水平在‘紫枝玫瑰’的一、二、三级侧枝中呈逐级递减趋势,存在显著差异。RrRAX3表达量与生长素(IAA)和赤霉素GA3含量呈正相关,与玉米素(c-Zeatin)和脱落酸(ABA)呈负相关,而与赤霉素GA1关性不明显。4.获取目的基因后,成功构建了RrRAX3基因的CRISPR/Cas9载体pCas9-RrRAX3以及过表达载体pCAMBIA1304-RrRAX3。然后采用农杆菌介导的体细胞胚转化法将空载体pCAMBIA1304、pCas9-RrRAX3基因敲除载体和过表达载体pCAMBIA1304-RrRAX3 同源转化‘保白玫瑰’(Rosa rugosa‘Baobai’),经 GUS 染色法验证,获得了转基因体细胞胚,并已萌芽。