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抗生素的滥用导致多重耐药的超级细菌频现,给临床治疗带来了巨大困难,同时由于抗生素新药研发的减缓,耐药菌已成为全球公共卫生的最大威胁之一。金黄色葡萄球菌,简称金葡菌,是导致多种感染性疾病的重要病原菌。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）等的出现及其耐药性的快速增长,给金葡菌感染的临床治疗带来了严峻挑战。因此,不仅需要开发新型抗生素,还必须建立快速灵敏的耐药菌检测和药敏试验方法,以实现对细菌感染的高效诊断和后续治疗的精准决策。本研究重组表达了MRSA噬菌体内溶素LysP108及其细胞壁结合域（Cell wall binding domain,CBD）并验证了其活性。基于CBD对MRSA的识别作用,结合双夹心荧光分析法建立了MRSA检测和药敏试验的新方法,并基于内溶素对MRSA的裂解作用,探索了其在MRSA感染治疗中的应用。（1）噬菌体内溶素及其细胞壁结合域CBD的表达纯化噬菌体内溶素是噬菌体侵染细菌后期由噬菌体基因编码合成的一种细胞壁水解酶。通常,革兰氏阳性菌的内溶素是由具有细胞裂解能力的N-末端酶活性域和具有细胞壁结合能力的C-末端结合域组成。我们选择本实验室保存的MRSA噬菌体P108（GenBank登录号:NC025426）,通过美国国家生物技术信息中心（NCBI）检索和局部序列比对工具BlastP分析,确定了噬菌体内溶素LysP108及其细胞壁结合域CBD的DNA序列,并根据相关DNA序列设计了引物。利用限制性核酸内切酶Nde I和Not I双酶切质粒pET-21a和CBD、LysP108基因的PCR产物,再通过Gibson连接,构建了重组载体pET-21a-CBD和pET-21a-LysP108。同时我们将表达绿色荧光蛋白的gfp基因与CBD基因进行融合表达,构建重组载体pET-21a-CBD-GFP。然后采用大肠杆菌表达体系,表达并纯化了CBD、CBD-GFP和LysP108重组蛋白。实验结果表明,经过IPTG诱导表达,大量水溶性的CBD、CBD-GFP和LysP108存在于大肠杆菌细胞中。经纯化,得到了分子量大小分别为13 kDa、35 kDa和34 kDa的蛋白质溶液,它们的分子量大小与预期相符。（2）基于噬菌体CBD识别的MRSA检测及其药敏试验与菌株特异性MRSA噬菌体不同,CBD蛋白对MRSA的所有五种葡萄球菌染色体mec基因盒类型均表现出广谱识别能力。此外,CBD没有表现出对宿主细菌的裂解活性,并且能够区别死活菌,从而可实现对完整MRSA活细胞的捕获,并为后续的细胞操作和示踪提供较高的灵活性。为了证明其应用潜力,我们将CBD作为识别试剂,结合磁分离技术,并将CBD-GFP作为信号探针,建立了一种基于流式细胞仪的双夹心荧光法,实现了对MRSA菌株的广谱检测。研究结果表明,MRSA检测的线性范围为1.5×102-1.5×106 CFU mL-1,检测限低至40 CFU mL-1。而革兰氏阴性菌或其他革兰氏阳性菌对MRSA的检测几乎没有干扰,表明本方法具有较好的选择性与特异性。同时,本方法还被成功应用于生理盐水注射液、湖水和人尿液中MRSA的检测,回收率在81.0%-104.8%之间。我们进一步将该双夹心荧光法应用到MRSA的药敏试验中,通过酶标仪在2.5 h内完成测定,快速获得了药敏试验结果。（3）噬菌体内溶素LysP108的抗菌作用研究内溶素作为一种潜在的抗菌物质,可直接自外裂解革兰氏阳性菌,并且不易产生耐药性。因此,内溶素被看作治疗多重耐药病原菌感染的重要武器。通过标准平板计数法发现,噬菌体内溶素LysP108可直接裂解金葡菌和和外膜受损的铜绿假单胞菌,导致活菌数量出现1-3个数量级不等的减少。酶活性实验发现,该内溶素的最适工作浓度为250μg m L-1,最适pH为7.0,最适温度为37℃。活死菌染色结果表明,该内溶素具有很强的杀菌能力,杀菌率达到约90%。结晶紫染色结果表明,该内溶素还具有抑制和破坏细菌生物被膜的作用。体内动物实验结果显示,与单一疗法相比,联合注射内溶素LysP108和万古霉素后小鼠MRSA感染皮下脓肿面积明显减小,说明内溶素Lys P108与万古霉素之间存在协同抗菌作用。因此,内溶素LysP108有望与各种抗生素联用,从而在多重耐药菌感染的治疗方面发挥重要作用。