土传病害是指生活在土壤中的病原微生物,在条件适宜时,从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。由于连茬耕作、长期施用化肥等问题,导致土壤中有害微生物的种类和数量增加,有益微生物的种类和数量急剧减少,微生物区系严重失调,土传病害进一步加重。枯萎病是一种真菌性土传病害,尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是引起该病害的主要病原菌,该菌株从根部侵染植物,破坏植物维管束,导致植物枯死,对棉花、番茄、黄瓜、冬瓜、甜瓜、丝瓜等经济作物危害严重。本研究以枯萎病为研究对象,利用对峙实验、发酵实验、盆栽实验、田间试验、生物统计相结合的方法,系统研究黑根霉(Rhizopus nigricans)和拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)对植物枯萎病的协同防治作用。本研究主要取得以下研究结果及结论：1.生防菌的筛选：利用对峙实验测定5种丝状真菌包括黑根霉(R.nigricans)、拟康氏木霉(T. pseudokoningii)、拟康氏木霉I(T.pseudokoningii I)、对植物枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的4种专化型(黄瓜专化型、山药专化型、茄科专化型、禾谷专化型)和植物灰霉病病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抑制效果,结果表明,5种生防菌对5种病原菌均表现出不同程度的抑制作用。其中,黑根霉和拟康氏木霉对5种病原菌都有较为明显的抑制作用,抑制率均高于55.0%。所以,以下实验选择黑根霉和拟康氏木霉为研究对象,进一步分析其对枯萎病防治效果。2.混合发酵：以拟康氏木霉作为目标菌,黑根霉作为挑战菌,将黑根霉和拟康氏木霉按照不同比例接种量(1：1、1：2、1：3、1：4、1：5)接入到PDB培养基,进行混合发酵10天。利用菌丝生长速率实验测定生防菌发酵液对尖孢镰刀菌黄瓜转化型和灰葡萄孢的抑制作用,结果发现,黑根霉发酵液和拟康氏木霉发酵液对两种病原菌的抑制率分别为17.6%和47.1%、77.2%%和55.9%；1：1和1：2接种量的混合发酵,提高了发酵液对病原菌的抑制率,分别达到85.3%、67.6%、85.3%、70.6%；1：3、1：4、1：5反而降低了发酵液的抑菌效果。以下所用拟康氏木霉和黑根霉混合发酵液均为按照1：1接种量发酵。3.生防菌发酵液对黄瓜枯萎病的防治效果：温室条件下,通过伤根处理的方法,在黄瓜根部接种107 cfu/ml的尖孢镰刀菌孢子悬浮液,黄瓜发病率达100%。与只接种病原菌的对照组相比,拟康氏木霉发酵液处理组、黑根霉发酵液处理组的黄瓜发病率分别为68.7%、75.0%,相对防效分别为31.2%、25.0%。黑根霉和拟康氏木霉混合发酵液处理组的黄瓜发病率为56.3%,相对防效为43.7%,表明黑根霉和拟康氏木霉的混合发酵液对黄瓜枯萎病的防治效果比单一生防菌的防治效果强。4.病原菌的定量追踪：利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白标记的病原菌在黄瓜植株各组织内的含量,结果表明,在黄瓜植株根茎部出现褐变现象时,与病原菌处理的对照组相比,黄瓜根部、茎部及根际土壤中的病原菌含量最高,黑根霉和拟康氏木霉混合发酵液处理组的黄瓜根部、茎部及根际土壤中的病原菌含量最低。5.实时定量PCR实验检测黄瓜各组织及土壤中尖孢镰刀菌的含量：尖孢镰刀菌通过在根际土壤中定殖,侵染植物根系,进而侵染到植物根茎部的维管束组织,此时,植物的根茎部会出现褐变现象,植株开始萎焉。对黄瓜茎秆中的病原菌进行定量,结果表明,黑根霉和拟康氏木霉混合发酵液处理组、拟康氏木霉发酵液处理组、黑根霉发酵液处理组的抑制率分别为22.7%、18.5%、11.9%；对黄瓜根系中的病原菌进行定量,三种处理组的抑制率分别为24.3%、17.1%、7.2%；对黄瓜根际土壤中的病原菌进行定量,三种处理组的抑制率分别为20.5%、10.6%、6.9%。该结果进一步表明,黑根霉和拟康氏木霉协同作用抑制了病原菌的侵染。6.植物酶活实验测定黄瓜防御酶的变化趋势：通过对五种处理的不同时间段进行取样,检测过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的酶活变化趋势,结果表明,与单一生防菌发酵液相比,混合生防菌发酵液处理组的黄瓜防御酶反应速率最快,维持时间最长。7.田间实验：通过对试验田进行两年的处理,从第一次用黑根霉和拟康氏木霉混合发酵液处理对棉花枯萎病的没有防治效果,到经过五次处理之后,对棉花枯萎病的相对防效达到76.5%,并且棉花的株高,叶片浓绿程度及棉花花铃数都有显著的提高。综上所述,本文通过尖孢镰刀菌筛选出具有生防作用的黑根霉和拟康氏木霉,用这两种真菌菌株制成的生物菌剂,具有防治枯萎病、改良土壤及促进棉花品质的作用,今后应进一步研究该生防菌在有机肥上的应用。