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学习和记忆是脑的重要机能之一,也是人与动物赖以生存和进化的关键。现代社会高压力及人口老龄化导致不同年龄阶层人出现记忆障碍、衰退已成为威胁公共卫生安全的主要健康问题。本文旨在通过生物酶解技术高效制备改善记忆肽,探讨其改善记忆的作用。主要通过对比研究不同蛋白源酶解产物的改善记忆功效,优选制备改善记忆肽的蛋白原料;采用可控酶解技术高效制备富含改善记忆肽的核桃蛋白酶解产物,深入研究其对记忆受损小鼠行为学、胆碱能系统及大脑CA3区神经元的改善影响,明晰其改善记忆功效及可能作用机制;系统研究改善记忆肽粉的粉体性能,开发改善记忆肽直压新产品,为新型营养健康食品创制提供理论和方法指导。(1)通过对比研究大豆蛋白酶解产物(Soybean protein hydrolysate,SPH)、核桃蛋白酶解产物(Walnut protein hydrolysate,WPH)、花生蛋白酶解产物(Peanut protein hydrolysate,PPH)和鳕鱼蛋白酶解产物(Cod protein hydrolysate,CPH)的组成及体内、体外改善记忆功效。发现植物蛋白酶解产物肽分子量集中在1-3 KDa范围,而CPH中<1 KDa组分最高(39.29%)。WPH富含改善记忆功效的氨基酸(精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸)。在用MTT法测定的PC12细胞存活实验中,在低浓度(0.100.20 mg/ml)时,只有SPH会显著有利于细胞存活;PPH(1.00 mg/ml)和CPH(1.00 mg/ml)要达到相对较高浓度时才显著有利于细胞存活;对于WPH来说,在0.50mg/ml浓度显示出显著效果,达到p<0.01的水平,从细胞存活角度SPH和WPH改善记忆效果较好。预添加2 mg/ml蛋白酶解产物可明显抵制H2O2对PC12细胞对的损伤,其中SHP和WPH相对较好。小鼠跳台实验研究发现,WPH能显著提高正常小鼠的记忆获得、巩固和再现能力,效果最好。对于樟柳碱损伤小鼠,四种蛋白酶解产物在各阶段作用存在差异,SPH能较好改善记忆受损小鼠的获得性记忆;四种蛋白酶解产物均能显著性改善记忆受损小鼠的巩固性记忆,其中SPH、WPH、CPH效果较好;仅有SPH和PPH能显著改善受损小鼠的再现记忆。四种蛋白酶解产物的体外乙酰胆碱酯酶抑制活性由强至弱依次为WPH>SPH>CPH>PPH,表明蛋白酶解产物的体外乙酰胆碱酯酶抑制活性与PC12细胞实验、小鼠体内功效结果存在一定相关性。综合肽分子量分布、氨基酸组成、细胞实验、动物实验及体外乙酰胆碱酯酶抑制活性,优选脱脂核桃粕为实验原料。(2)选用脱脂核桃粕为实验原料,系统研究碱溶酸沉提取工艺参数对蛋白浸出率的影响,确定核桃蛋白提取工艺:pH 9.0碱溶液与核桃粕粉为16:1,在55℃下提取2 h,酸沉pH为4.0,蛋白提取率可达47.15%。以酶解效率(蛋白回收率和水解度)和乙酰胆碱酯酶抑制率为导向,优化核桃蛋白制备核桃改善记忆肽工艺:碱性蛋白酶Alcalase2.4L酶添加量8‰(酶量/底物蛋白,g/g),风味蛋白酶添加量2‰(酶量/底物蛋白,g/g),酶解时间为12 h,底物蛋白浓度为8%,蛋白回收率和肽得率分别高达85.23%和68.94%,乙酰胆碱酯酶抑制活性为54.37%。鼠Morris水迷宫撤台实验结果显示WPH在改善小鼠空间探索能力方面显示出与吡拉西坦相当的作用,能显著降低小鼠逃避潜伏期降低及显著增加平台穿越次数(p<0.05),甚至达到造模前水平,表明WPH能有效改善东莨菪碱对小鼠的空间记忆障碍。(3)采用小鼠学习与记忆能力行为学评价对比不同水解时间(8 h、12 h、16 h)WPH改善记忆功效,发现WPH-16具有更好的记忆改善作用,表明不同酶解时间释放或聚集新的改善记忆肽;WPH-16主要通过增加AchR含量来改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤的作用。中、高剂量WPH-16可显著抑制或改善毛细血管的变形、肿胀、维持神经元基本形态、增加突触的数量、长度及突触前膜颗粒物质的分泌,WPH-16高剂量对上述病理变化的抑制或改善作用更加明显,表明核桃生物活性肽对海马区神经元结构具有强的保护作用。(4)通过系统研究核桃改善记忆肽粉体性能,发现改善记忆肽粉粒子形状为不规则多边形、原料属于塑性物料,可压性好,但流动性差,易吸潮。通过正交试验分析,确定直压片优化配方:核桃改善记忆肽:赤藓糖醇:微晶纤维素:硬脂酸镁+二氧化硅(2:1):香精=40:37.5:20:1.5:1。并优化核桃改善记忆肽复方的生产工艺参数:三维混合、转速6 rmp/min、混合时间为10 min,压片压力为20 kN,压片速度为30 rmp/min。通过加速试验和长期稳定性测试表明改善记忆肽片剂符合标准要求,具有广阔市场前景。