肝脏是人体最大的消化器官,也是新陈代谢的中枢,承担着分泌胆汁,调节血液平衡,解毒,糖代谢,免疫以及胚胎早期造血等功能。脊椎动物中,肝脏是由早期前肠内胚层细胞分化发育而来,随着细胞的分裂和分化逐渐形成了一个具有复杂结构和细胞类型的实质性器官。肝脏的主要细胞类型包括肝实质细胞、胆管细胞、星状细胞、内皮细胞以及Kupffer细胞,其中肝实质细胞是肝脏功能的主要承担者,是肝脏中最大的细胞类群。在生命活动中,肝实质细胞容易因各种外界因素诱导损伤,这往往会引发各类肝脏病变。我国目前已经是世界第一的肝病大国,对肝脏尤其是肝实质细胞的发育,成熟以及损伤再生机制的研究成为了现代生物学和医学的热点领域,具有重要的社会意义。mTOR即哺乳动物雷帕霉素靶蛋白,因其能被雷帕霉素特异性抑制而得名。mTOR蛋白是一个典型的丝氨酸/苏氨酸激酶,能与RAPTOR（复合物1）,RICTOR（复合物2）,LST8,以及m SIN1等组成复合物mTORC1/2,该复合物能磷酸化下游靶基因,最为人们所熟知的有S6k1,4EBP1,AKT,PKC。mTOR复合物是主要的细胞代谢调控因子,它能响应细胞内、外环境中的营养条件、生长信号以及环境压力,来调整细胞的代谢,增殖以及衰老等生命过程。异常的mTOR信号往往会引发多种人类疾病,比如糖尿病和癌症。因此,mTOR信号是一个很有前景的靶蛋白分子,具有重要的临床价值。斑马鱼是一种具有远大应用前景的模式动物。自1981年George Streisinger建立起完善的斑马鱼实验和养殖体系以来,迅速被应用于多个研究领域。斑马鱼相对较小的体型、较短的性成熟期以及强大的繁殖能力使得研究人员能够以非常低的实验成本在短时间获得大量实验材料,便于大规模的药物和遗传诱变筛选;而且斑马鱼的早期胚胎是透明,对其内部组织和器官的观察就变得非常简单;同时斑马鱼与人类的基因组高度相似,能很好地模拟人类的器官发育和组织再生过程。这些优势使得斑马鱼在药理病理,环境监测,以及器官的发育和再生等领域都能一展所长。。器官的发育和再生一直是医学和生命科学研究中最为重大的问题之一。为了研究肝脏的发育与再生的调控机制,我们实验室很早前就构建了一个特异性标记肝实质细胞的转基因系Tg（lfabp:Dendra2-NTR）cq1。该转基因系不仅能特异性地标记肝实质细胞,并且能通过在egg water中加入Methazolamide的方法来特异性杀伤斑马鱼肝实质细胞从而损伤肝脏。基于该转基因系,我们利用ENU处理来诱导斑马鱼基因组中的单碱基随机突变,随后通过观察子代斑马鱼的肝脏荧光信号来筛选出影响肝脏发育和再生的突变体,结合图位克隆和DNA测序就可以筛选出影响肝脏发育和再生的基因。通过筛选,我们得到了一个非常特异的斑马鱼肝脏发育突变体cq96。在发育第五天,该突变体肝脏区域的荧光信号极弱,且肝细胞间的荧光强度存在显著差异并伴随有细胞增大的现象。突变体肝脏区域还存在一部分不表达或弱表达肝脏荧光的细胞。通过原位杂交实验我们发现突变体肝脏特异性基因的表达显著降低,但是胰腺和肠道相关基因的表达正常。这些实验结果表明,该突变体表现出特异的肝脏发育缺陷。肝脏的发育可以被分为两个阶段:肝脏命运的特化阶段（肝脏出芽）以及生长,分化阶段。我们在发育60小时检测了能标记早期内胚层和肝芽的重要转录因子hhex、foxa3、gata6、prox1的表达情况,此时的肝脏出芽已经完成并处于快速增殖的阶段。原位杂交实验表明该突变体的内胚层发育正常,而且肝脏命运决定不受影响,肝芽的大小没有表现出异常。同时我们还发现发育第5天的突变体肝脏区域并未出现前体细胞基因的高表达,且肝脏重要转录因子hnf4a的表达也并未受到影响,这表明突变体的肝脏母细胞已经向肝脏细胞进行了分化,但肝脏细胞的功能受到了突变基因缺失的影响。进一步的免疫荧光染色结果表明该突变体胆管系统发育正常,但两个重要的肝脏转录因子Hnf4a、Prox1水平显著下降,这两个转录因子对肝脏基因的表达及功能的完备十分重要。在器官发育过程中,细胞的增殖和凋亡是受到严格调控的,而突变体肝脏区域荧光弱且阳性细胞数目少于野生型,可能与肝脏实质细胞的异常增殖和凋亡有关。通过对PCNA的免疫荧光染色和TUNEL染色结果的分析,我们发现该突变不影响肝脏细胞的增殖和凋亡。通过图位克隆,我们发现突变体的肝脏发育缺陷是由rbm15的突变所致。该基因编码了一个RNA结合蛋白,并在RNA甲基化修饰,m RNA出核等过程中发挥了重要作用。原位杂交和荧光原位杂交的结果表明,该基因在发育第五天时在肝脏区域高表达。为了验证图位克隆的结果,我们通过CRISPR/Cas9敲除了该基因,并重现ENU突变体的表型;同时我们利用过表达系Tg（Hsp7ol:rbm15-Flag）在突变体中过表达Rbm15,48小时后突变体肝脏的荧光标记得到了显著增强,原位杂交的结果也表明肝脏功能性基因的表达也得到了显著提升。这些实验结果表明Rbm15的功能缺失影响了肝实质细胞的成熟。由于mTOR信号影响了肝脏的增殖和再生,且在肝脏的代谢中发挥了非常重要的作用,于是我们检测了mTORC1的下游蛋白4EBP1的磷酸化水平,免疫荧光染色结果表明突变体中p-4EBP1的水平显著强于野生型,这意味着mTORC1的异常激活可能是肝细胞成熟异常的原因。随后的雷帕霉素处理成功地回救了突变体肝脏表型,同时Hnf4a的细胞核内蛋白水平以及肝脏特异性基因的表达也得到了回救。我们的研究首次发现rbm15的缺失能非常特异地影响斑马鱼肝脏的成熟,但不会影响肝细胞的分化以及肠道、胰腺的正常发育。并证明了该基因的缺失会导致高水平的mTORC1的激活从而抑制肝实质细胞的成熟。这一实验结果表明在肝脏发育的过程中,mTORC1的活性应当受到严格调控,过高的mTORC1对器官的发育会带来负面影响。这一研究对临床治疗肝脏疾病具有十分重要的指导意义,值得更深入地探索。