前言神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是起源于交感肾上腺链的恶性实体瘤,在儿童恶性肿瘤发病率中占第4位,仅次于白血病,脑瘤和淋巴瘤。据估计我国每年都有3000以上新发病例。近20年来,对神经母细胞瘤发生发展机制的研究取得了很大进展,治疗方法亦有许多改进,但临床疗效并无显著提高,恶性神经母细胞瘤患儿的5年生存率仍不足10%,严重威胁着儿童的健康和生命,是基础研究和临床治疗亟待解决的难题之一。依赖性受体是目前肿瘤研究的热点,作为跨膜受体蛋白为细胞内外信息传递提供重要的途径。Unc5H家族即为依赖性受体中的新成员,在神经系统发育过程中对轴突的延伸、神经元的迁移等起着至关重要的作用。NTN1基因编码了Unc5H家族的特异性配体Netrin-1蛋白,在大约50%的神经母细胞瘤和脑肿瘤中均发现NTN1基因表达的显著下降或缺失,并且存在NTN1的错译突变,提示NTN1及其受体基因在NB发生发展中发挥作用。Unc5H家族成员在特异性配体Netrin-1存在时,向细胞传达有关分化,增殖及游走等正向信号,而当缺乏Netrin-1表达时,它们却变成杀伤性武器,指引细胞走向凋亡,从而发挥条件性肿瘤抑制基因的作用。目前国外已有报道Unc5H1,Unc5H2,Unc5H3在神经系统肿瘤及结肠直肠癌中具有双向调节作用,而Unc5H4的分子生物学机制目前尚无报道。该生在日本千叶县肿瘤研究所研修期间利用基因芯片技术在原代神经母细胞瘤cDNA文库中成功鉴定出名为Nbla00613的新基因,并证明该基因编码了Netrin-1受体Unc5H家族的一个新成员Unc5H4。前期研究发现Unc5H4在良性神经母细胞瘤中有高表达,提示Unc5H4可能为新型的神经母细胞瘤预后判定指标。目前临床上广泛应用神经母细胞瘤的分期和发病年龄作为预后的判定因素,MYCN的扩增与否及TrkA表达的高低作为主要分子生物学预后标记物。但是临床上仍有无转移灶且无MYCN扩增的NB长期预后差;恶性NB中存在TrkA高表达等矛盾现象,均提示除MYCN、TrkA外可能还有其他基因在神经母细胞瘤的发生发展中起着重要作用,Unc5H4即为其一,本研究将进一步证实Unc5H4可作为新型的具有独立预后指示作用的神经母细胞瘤标志物。良性神经母细胞瘤中有高Unc5H4表达的现象提示该基因具有诱导肿瘤细胞凋亡的功能,而p53是已知的重要肿瘤抑制基因,在人类半数以上肿瘤中均有p53基因的突变。在致癌因素存在时,细胞通过转录或转录后水平激活内源性p53的表达,而上调的p53又反过来在转录水平调节具有p53结合位点的目的基因的表达从而发挥肿瘤抑制作用。本研究致力于Unc5H4的条件性肿瘤抑制功能与p53关系的研究,以期发现新型p53诱导基因及凋亡信号传导途径。人体是复杂的有机整体,发育中基因表达的多样性,信号传导通路的错综复杂使神经母细胞瘤的研究更加深奥。依赖性受体和条件性肿瘤抑制基因的概念是近年研究的重大发现,而在神经母细胞瘤中发现和证实该种基因的存在为进一步揭示神经母细胞瘤的特殊生物学行为提供了全新和深入的理论依据,在神经系统发生发育过程中,Unc5H家族成员在有Netrin-1蛋白分泌区域能够诱导神经细胞存活、分化及轴突的延伸,但随着优化筛选后,机体通过抑制Netrin-1蛋白的分泌,而仅依靠Unc5H基因的独立表达诱导那些未能建立轴突联系的神经细胞发生凋亡,凋亡的延迟或消失则导致肿瘤发生。而神经母细胞瘤中p53基因的失活、Unc5H4基因的突变或Netrin-1基因的持续表达均可造成肿瘤的发生发展,重建p53、Unc5H4基因功能,抑制Netrin-1蛋白分泌等在理论上均可抑制神经母细胞瘤的发生发展,因而明确Unc5H4所激活的不同信号传导通路有利于从分子水平揭示神经母细胞瘤的发生发展机制,并为在基因水平治疗该疾病提供有力的分子生物学基础。方法一、临床部分1、临床资料:118例原发神经母细胞瘤cDNA,其中良性神经母细胞瘤56例,Evans分期属Ⅰ期、Ⅱ期及ⅣS期,平均生存时间43.8月;恶性神经母细胞瘤62例,Evans分期属Ⅲ期和Ⅳ期,平均生存时间34.7月。全部肿瘤均经术中、术后病理及分子生物学标记物确诊,患者确诊年龄为1月～14岁,平均年龄3.1岁。肿瘤标本均为初发未治。标本来源于日本千叶县肿瘤研究所神经母细胞瘤标本库,标本使用符合日本相关法律。2、RT-PCR:采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术对32例神经母细胞瘤cDNA标本中Unc5H4及其家族同系物Unc5H1-3的mRNA进行半定量检测,以初步明确Unc5H家族成员在良、恶性神经母细胞瘤中的表达模式。32例标本中包含16例良性神经母细胞瘤、16例恶性神经母细胞瘤。以GAPDH为内参照。3、荧光定量实时PCR:118例原发神经母细胞瘤标本cDNA已制备完成。制备标准曲线样品。标准曲线样品样品和待测样品分别加入到含SG的实时PCR反应液中进行实时PCR扩增和检测。检测结果进行标准曲线分析,对Unc5H4或Unc5H1/3基因进行定量。4、Kaplan-Meier生存分析:结合临床资料及Unc5H4在某一群体中表达模式进行生存分析。二、基础部分1、细胞培养:人骨肉瘤来源U2OS及SAOS2细胞系在DMEM培养液中培养,人肺癌细胞系H1299及人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y均在RPMI1640培养液中培养。培养基中含有10%热灭火胎牛血清,50U/ml青霉素及50μg/ml链霉素;细胞在37℃、5%CO2平衡浓度的细胞培养箱中培养,当细胞单层生长融合率至80%时传代或进行实验。在实验所设计的时间段用终浓度1μmol/L阿霉素的相应培养基换液处理。2、质粒转染:采用脂质体Lipofectamine2000介导转染技术,在H1299细胞中转染入p53质粒或对照空质粒;在U2OS细胞中转染入siRNAp53质粒或空质粒;在H1299细胞中转入PGL3—p53结合区质粒和p53质粒,转染方法参照相关转染试剂说明步骤。3、细胞生存分析:将U2OS、H1299及SH-SY5Y细胞以5×10³个细胞/孔分别接种于96孔板中,贴壁过夜,然后暴露于终浓度1μmol/L阿霉素中。在阿霉素处理后的指定时间内,加入10μl染色剂,在37℃培养箱内反应1hr,然后放入酶标仪,读取570nm波长下的O.D.值。4、RT-PCR:参照试剂盒使用方法,在实验细胞中通过RNessy Mini Kit提取总RNA,并用随机引物和SuperScriptⅡ逆转录酶得到cDNA。经PCR扩增的第一链来检验目的基因的表达水平。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离后,用溴乙锭显色。5、蛋白质检测（Western-blotting）:收集细胞经冷1×PBS液清洗后在SDS细胞裂解液中裂解（10%glycerol,5%β-mercaptoethanol,2.3%SDS,62.5 mmol/LTris·HCl pH 6.8）。再用蛋白检测染液测定蛋白浓度,相同蛋白含量的细胞裂解液加样于10%SDS聚丙烯酰胺电泳分离后,转移至PVDF膜,用含0.3%脱脂牛奶的TBS封闭非特异吸附,分别加入一抗抗体室温作用1hr,洗膜,并用相应二抗作用,在ECL系统显色。6、克隆构建实验:在U2OS和H1299细胞中转染入空质粒（pcDNA3）或Unct5H4表达质粒（pcDNA3-Unct5H4）48小时后,用400μg/ml G418的培养基进行14天筛选,耐药克隆用Giemsa染液染色,记录克隆数目。7、荧光素酶检测法:H1299细胞以5×10⁴细胞/孔接种于12孔板中贴壁过夜。转染体系包括100ng PGL3—启动子质粒,p53-RE₁,p53-RE₂,p53-RE₃及p53-RE₄,10ng Renilla荧光素酶标记结构及25ng p53-flag表达质粒。每一份转染所包含的质粒数为510ng,不足处以pcDNA3质粒填充,转染48小时后,裂解细胞并应用双色荧光素酶检测系统进行荧光素酶活性的检测,具体步骤参照试剂盒说明。8、染色质免疫沉淀分析法:在H1299细胞中转染空质粒或p53表达质粒,转染48小时后细胞在37℃条件下与含1%甲醛的培养液进行交联反应,得到交联的染色质后超声将其断裂为平均长度为200-800的核苷片段,应用脱氧核糖核酸/蛋白质A琼脂糖珠加以反复清洗后,对照使用正常鼠血清、实验组使用单克隆抗p53抗体进行免疫沉降。沉降物用100μl洗提掖（含1%SDS和1mM碳酸氢钠）洗提。甲醛介导的脱氧核糖核酸/蛋白质交联在65℃加热4小时条件下失效,反应物在45℃下蛋白酶K作用1小时。应用QIAquickPCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化基因组DNA。9、流式细胞仪检测凋亡:转染#1和#3的SAOS2细胞,应用1μmol/L ADR处理48小时,收集包括悬浮细胞在内的全部细胞。PBS清洗,-20℃70%酒精固定细胞,悬浮于phosphate—citrate液中,室温放置15分钟,Propidium Iodido使检DNA染色,并10μg/ml Rnase A抑制RNA酶作用,暗处反应30分钟,流式细胞仪检测细胞DNA含量并应用CellQuest软件处理数据。结果一、临床部分1、Unc5H4在良性神经母细胞瘤具有高表达:应用RT-PCR法在16例良性神经母细胞瘤cDNA和16例恶性神经母细胞瘤cDNA中检测Unc5H家族成员的表达模式发现Unc5H1/3/4均在良性神经母细胞瘤中有高表达的可能,进而在118例原发神经母细胞瘤cDNA中进行荧光定量实时PCR检测,结果显示Unc5H4在良性神经母细胞瘤中较在恶性神经母细胞瘤中有高表达,差值有显著统计学意义,而Unc5H1/3则无此种表达差别。2、在良、恶性神经母细胞瘤中Unc5H4高表达与长期临床预后相关:在118例神经母细胞瘤患儿中,良性56例,平均生存期为43.8月,而恶性神经母细胞瘤共62例,平均生存时间为34.7月,统计学处理显示,高Unc5H4表达与长期生存密切相关。3、在恶性及有MYCN扩增的神经母细胞瘤中,Unc5H4的高表达与肿瘤患儿长期临床预后相关:同样结论在恶性神经母细胞瘤及MYCN扩增组神经母细胞瘤患儿中均显示高Unc5H4表达与长期预后相关。证明Unc5H4是一个新型神经母细胞瘤的预后指示基因。二、基础部分1、Unc5H4诱导细胞包括神经母细胞瘤细胞的凋亡:在U2OS细胞系及SH-SY5Y细胞系细胞中,Unc5H4的表达能诱导细胞发生凋亡。2、Unc5H4的功能依赖于正常的p53基因功能:在阿霉素介导的DNA损伤型凋亡中,H1299细胞无p53表达,则其不能诱导Unc5H4的表达且不能诱导克隆形成减少,而含正常p53功能的U2OS细胞增均能实现。此外,在U2OS细胞中敲除p53基因的表达则阻断了阿霉素诱导凋亡功能和Unc5H4的内源性表达。3、Unc5H4是p53的直接转录目标基因:在Unc5H4内含子1序列中发现和证实了p53结合位点的存在。结论1、Unc5H4在良性神经母细胞瘤中有高于在恶性神经母细胞瘤中的表达。2、高Unc5H4表达与神经母细胞瘤的长期预后相关。3、Unc5H4是新型的神经母细胞瘤预后指示基因。4、Unc5H4诱导神经母细胞瘤细胞凋亡,此凋亡功能依赖于正常的p53功能。5、Unc5H4是p53直接的转录靶向基因。