神经肽是神经元分泌的细胞间信号分子,在体内充当神经递质,神经调节剂或神经激素,并且在生物发育各个阶段对各种生理功能起重要的调控作用。谷氨酰胺RF-酰胺肽（Pyroglutamine RF-amide peptide,QRFP）是RFamide家族中最新发现的成员,并被鉴定为GPR103内源性配体,GPR103通过与异源三聚体G蛋白结合发挥作用。GPR103及其配体广泛表达于大脑和外周组织中,参与调节体内诸如摄食和能量稳态、神经内分泌和骨骼发育等多种生理功能,可以作为诊断、预防和治疗能量稳态以及内分泌等相关疾病的有效药物靶标。神经肽QRFP前体肽可以水解产生两个C末端酰胺化的成熟肽,分别为26RFa和43RFa。先前的研究报道26RFa和43RFa神经肽均能特异性结合并激活GPR103,但两个神经肽激活GPR103介导的信号通路机制仍存在很大争议。本文中,我们首先检测了两个神经肽介导的信号通路,研究发现在HEK293T细胞中,26RFa刺激GPR103与Gαq和Gαi蛋白偶联,抑制c AMP的生成,并介导胞内Ca2+的动员以及ERK1/2的磷酸化,与先前的报道一致。与26RFa不同的是,43RFa可以激活GPR103与Gαs蛋白偶联促进c AMP的积累,并同时通过Gαq和Gαs蛋白介导Ca2+动员和ERK1/2的磷酸化。我们通过分子动力学模拟预测配体-受体相互作用并结合定点突变的方法,检测受体突变体和配体类似物激活受体介导的信号通路活性差异。结果显示突变体ECL2上的Lys189、Asp191和Leu 202残基对受体与Gα蛋白结合至关重要。在43RFa作用下,Lys189突变为丙氨酸导致受体选择性地与Gαi蛋白结合,Asp191突变为丙氨酸后仅激活Gαq蛋白;而丙氨酸替代Leu 202可致受体由Gαs和Gαq双偶联变为Gαi和Gαq双偶联。研究还揭示,截断N端8个氨基残基的35RFa同样激活GPR103与Gαs和Gαq双偶联,但把Phe10突变为丙氨酸的35RFa-F10A导致受体由Gαs和Gαq双偶联变为Gαi和Gαq双偶联。进一步活体研究表明,43RFa和26RFa均能促进小鼠胰岛细胞的胰岛素分泌,但作用机制不同。43RFa主要通过Gαs-c AMP和Gαq-Ca2+偶联的信号通路促进胰岛素分泌,且作用明显强于26RFa,而26RFa仅通过Gαq依赖的Ca2+信号通路促进胰岛素分泌。糖基化作为GPCR蛋白翻译后修饰的重要过程,影响着蛋白质折叠、分泌、表面表达、蛋白定位、转运、配体结合等多种生理功能。GPR103受体具有三个潜在的N-糖基化位点,两个位于N末端结构域(Asn5和Asn19),一个位于第一个细胞外环（ECL1）(Asn106),但迄今为止,它们在GPR103表达和信号转导中的作用尚未确定。我们结合定点突变的方法（天冬酰胺替换为谷氨酰胺）与糖苷酶PNGase F和N糖基化抑制剂Tunicamycin（衣霉素）,研究N-糖基化在调控GPR103细胞表面表达和信号转导中的作用。结果显示,位于N端的N19和ECL1的N106是N-糖基化位点,位于N5的天冬酰胺并未被糖基化。共聚焦显微镜和定量ELISA分析显示,GPR103的N-糖基化作用对靶向细胞膜并不重要。然而,进一步的结合实验和功能实验表明去除N-糖基化或衣霉素处理导致受体与26RFa结合能力以及介导下游信号通路的能力显著减弱。因此,我们的研究结果表明,对于人QRFP受体GPR103,N糖基化对细胞表面表达并不重要,但却是配体结合和受体激活的先决条件。综上所述,本研究主要从GPR103与配体相互作用及蛋白翻译后修饰对受体的功能影响两部分探索GPR103受体信号转导机制。进一步加深我们对A类GPCR与它们的肽配体尤其是RF家族神经肽与它们的同源受体之间相互作用的理解,为设计以GPR103为靶点的激动剂和拮抗剂药物奠定了基础。