背景和目的:心肌缺血再灌注损伤（IRI）常见于急性冠脉综合症、心绞痛患者,是冠脉介入术后常见的病理生理现象,也是导致心力衰竭的主要损伤环节。而相关研究表明,38%的发生急性心肌缺血事件的患者常常会由于传统临床检测手段如心电图、早期血清心肌酶标记物等检查结果不具诊断性导致诊断延迟,甚至漏诊。超声心动图的室壁运动分析和对比超声灌注成像虽然能够提供一些额外的信息来指导临床治疗,但其对于心肌缺血再灌注损伤的检测提供的指导信息有限。因此,如果能够发展一种技术检测手段,在心肌缺血事件发生之后仍能够依靠对“缺血记忆”成像对曾发生缺血事件的心肌部位和范围做出评价,这无疑具有重大临床意义。心肌发生IRI时,P-选择素几分钟内在血管内皮细胞表面迅速表达,并在此后的几个小时内持续存在,促进血小板和中性粒细胞沿血管内皮滚动、粘附、聚集和外渗,后者可介导血管内皮炎症反应并释放多种炎症介质或促炎细胞因子,如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素-1（IL-1）,血栓素A2（TXA2）等,进而导致心肌组织微血管及细胞损伤,是造成心肌IRI的重要原因。近年来,随着靶向超声微泡造影剂的出现,靶向超声分子显像（targetedultrasound molecular imaging）逐渐成为现实,极大的拓展了传统超声微泡的应用范围,使应用超声技术从分子水平对各种疾病进行早期诊断成为可能。目前,虽然国际上已经有一些实验室应用靶向超声分子成像技术成功对肾脏、肿瘤和脑组织等部位进行了评价,但心肌超声分子成像由于成像技术、对微泡的稳定性、浓度等都有更高的要求,因此,能成功实现心肌超声分子成像的研究报道不多,而国内尚未见有应用高效价靶向微泡评价心肌微血管内皮炎症反应的报道,相关研究基本还没有实质性进展。我们实验室经过多年的探索和技术改进,靶向微泡构建研究也取得了相当大的成果,构建的靶向微泡大小和浓度、稳定性抗体携带率等均已达到国际同等或更高水平,并且依靠血管内皮炎症相关因子（P-选择素）靶向微泡成功实现了对肾脏的血管内皮炎症反应评价。因此,本研究尝试利用构建的心肌血管内皮炎症相关因子靶向微泡和对比超声相结合,并采用先进的超声成像技术（将对微泡的破坏性降到最低）对心肌IRI进行早期评价和诊断,这无疑将对临床早期防治心肌IRI发挥重要作用。因此,本研究在普通脂质微泡的基础上,通过“抗生物素蛋白/生物素复合体”的化学桥接作用将抗小鼠P-选择素单克隆抗体连接于脂质微泡外壳构建了携带抗P-选择素单抗靶向微泡（MBp）,并在心肌IRI小鼠模型上,应用MBp和心肌对比超声（MCE）检查相结合,目的在于探讨MBp结合MCE评价小鼠心肌IRI的可行性。材料和方法:1.超声微泡的制备:各种相关脂质材料按一定质量比例75℃水浴溶解于适量蒸馏水中,同时通全氟丙烷（C₃F₈）气体,超声振荡至形成乳白色液体制备普通脂质微泡或生物素（biotin）化脂质微泡（MB）。MB经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化1次后,按一定比例加入抗生蛋白链菌素（streptavidin）。继续静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗生蛋白链菌素纯化微泡1次后,按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-选择素单克隆抗体（biotin coniugated rat anti-mouse P-selectin monoclone antibody）和同型对照抗体（isotype control antibody）,分别得到携带抗P-选择素单抗靶向微泡（MBp）和同型对照微泡（MBc）,最后静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗体纯化微泡1次,冰箱中4℃保存备用。采用库尔特计数仪测量超声微泡的平均粒径及浓度。2.携荧光FITC超声微泡的制备:MB经静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合脂质纯化1次后,按一定比例加入FITC-抗生蛋白链菌素（streptavidin）,得到携荧光FITC的MB。继续静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合FITC-抗生蛋白链菌素抗生蛋白链菌素纯化微泡1次后,按一定比例加入生物素化的抗小鼠P-选择素单克隆抗体,得到携带荧光FITC的MBp,最后静置弃下清液并加入等量蒸馏水去除未结合抗体纯化微泡1次,冰箱中4℃保存备用。3.超声微泡体外评价:采用绿色荧光标记的二抗与抗P-选择素单抗结合荧光显微镜下观察抗P-选择素单抗与微泡的连接情况。4.超声微泡体内评价:应用携荧光FITC的超声微泡和荧光显微镜相结合,直视下观察超声微泡在小鼠提睾肌微循环中的行为特征,并对超声微泡粘附途径/效能进行评价。5.动物模型的制备和分组:5.1.提睾肌炎症模型的制备:20只实验小鼠随机分为2组,对照组和TNF-α（tumor necrosis factor-α）处理组。构建小鼠的提睾肌炎症模型后,再根据随机注射超声微泡的不同,分为MBp组和MB组。所有小鼠采用戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉。麻醉后,将小鼠仰卧位固定四肢于自制平台的透明垫上,尾静脉插管用于微泡的注入。TNF-α处理组以TNF-α50ug稀释到0.3ml的盐水中,阴囊注入。2小时后分离出提睾肌,并将其最大程度的平铺在自制平台的透明垫上,然后将透明垫鼠板放置于荧光显微镜上。实验过程中用恒温平衡克氏液持续缓慢滴在提睾肌上。5.2.心肌缺血再灌注模型的制备:10只实验小鼠常规麻醉后,尾静脉插留置针用于注射微泡。经胸骨左侧第四肋间开口,钝性分离皮下肌肉,暴露心脏,结扎左前降支血管。实验过程中心电图实时监视,以心电图ST段抬高≥0.1mv作为模型成功标志。结扎10min后,去除塑料管,撤掉结扎线。以ST段恢复正常作为再灌注模型成功标志。10只心肌缺血再灌注小鼠先后随机注入MBp和MBc后行MCE检查,并根据注入超声微泡的不同分为MBp组和MBc组。6.超声微泡粘附性能评价:小鼠提睾肌炎症模型建立后,尾静脉注入5×10⁶个MBp或MB,用适于观察荧光标记脂质微泡（470-490nm）的荧光过滤器和高分辨率制冷相机记录5min内20高倍镜视野下MBp或MB在微循环（主要是20-40gm的小静脉）中的粘附数量和粘附途径;采集荧光标记脂质微泡荧光和常光下在血管内的粘附图像,存于个人计算机,并对不同粘附途径的微泡数量进行分类汇总。7.心肌MCE检查及图像分析:动物模型制备后,用支架固定超声探头（17L5）于小鼠心腔上方,调整探头位置获得良好的左室短轴切面显像后保持探头位置在整个实验过程中不变,仪器的各项参数在整个实验过程中不变。灌注成像和MCE检查均采用相干脉冲序列成像技术（Coherent Pulse Sequence,CPS）成像方式实时观察,探头发射频率为7.0MHZ,机械指数（MI）为0.2。灌注成像:结扎小鼠冠脉后,静脉注入5×10⁵个MB,评价心肌灌注缺损区域。靶向超声成像:每只小鼠采用微量进样器经尾静脉随机（间隔30min）先后注射MBc和MBp的数量约为1×10⁶个。在注入微泡5min后行MCE,获取第一帧图像后给予高MI的连续超声发射2-3s以破坏微泡,继续存储本底图像2-3帧,全部声学造影图像存于CD盘,以备脱机分析。第一帧图像声强度（VI,视频密度）可代表靶向微泡在组织中的总浓度,包括粘附和循环微泡。微泡破坏后存储图像上的VI反应的是在血池中循环微泡的浓度。前者减去后者得到的是粘附微泡在组织中的浓度。取图结束后,应用MCE图像分析软件对图像进行分析,测量小鼠心脏造影的VI值,并用彩色编码技术制作心脏显影的彩色编码图像,采用红色、橙色和白色依次代表心肌显影的强度由弱到强。8.统计分析:使用SPSS13.0统计分析软件进行统计学分析,所有数据均以（?）±s表示。实验一统计分析,采用one-way ANOVA分析,方差不齐则选用近似F检验Welch法。组间多重比较方差齐性采用LSD检验,方差不齐则采用Dunnet T3检验。实验二组间比较采用二阶段交叉设计方差分析,组内比较采用配对T检验。α=0.05为显著性检验标准。9.病理学及免疫组化检查:图像采集完成后,取出小鼠心脏,10%甲醛固定,行病理学检查及免疫组化检查。结果:1.超声微泡制备情况:采用库尔特技术仪测得库尔特计数仪测得MBp浓度为1.06×10⁹个/ml,微泡平均粒径为2.30±1.06μm;MBc浓度为1.03×10⁹个/ml,微泡平均粒径为2.07±1.13μm。2.超声微泡体外评价结果:采用绿色荧光标记的二抗与抗P-选择素单抗结合,荧光显微镜下观察显示MBp外壳显明显绿色荧光,表明抗P-选择素单抗与微泡外壳连接良好。3.超声微泡体内评价结果:携荧光FITC的MB通过白细胞的介导实现和血管内皮的非特异性靶向,而MBp则可直接与血管内皮结合实现特异性靶向,显示了特异的粘附性能。TNF-α处理组MBp粘附数量多达12.0±2.6个/视野,MB仅为3.0±1.2个/视野,两者相比具有显著差异（P=0.002）;而对照组MBp和MB粘附数量分别为1.4±0.6个/视野和2.4±1.1个/视野,两者之间未见显著差异（P=0.472）。TNF-α处理组MBp粘附数量与对照组MBp和MB粘附数量相比差异显著（P=0.002）,并分别为对照组MBp和MB粘附数量的6.4±1.7倍和9.9±2.1倍。4.MCE检查结果:MBp组的第一帧MCE图像显示缺血区域可见显著造影增强,而非缺血区域无明显超声显影;MB组第一帧MCE图像缺血区域只见轻度造影增强,其显影强度较MBp组缺血区域明显减弱,非缺血区域未见明显超声显影。5.对比超声VI分析:VI值在MBp组和MBc组非缺血区均未见显著增大,分别为6.53±0.95和6.41±0.78,两者之间无显著性差异（P=0.522）;而在缺血区MBp组（25.98±6.23）较MBc组（9.12±0.91）显著增大,两者之间差异具有显著性（P=0.000）。MBp组缺血区VI值为非缺血区的4.03±1.08倍（P=0.000）,而MBc组缺血区VI值仅为非缺血区的1.44±0.18倍（P=0.000）。6.心肌病理及免疫组化检查结果:HE染色切片显示,非缺血区心肌组织可见心肌纤维结构正常,间质无充血水肿,缺血区心肌可见轻微心肌间质水肿、结缔组织疏松,血管周围可见少量淋巴细胞浸润等早期炎症性改变。免疫组化结果示,缺血再灌注心肌组织非缺血部位血管内皮无明显P-选择素表达,而缺血区血管内皮P-选择素表达明显增加。结论:1.采用“抗生物素蛋白/生物素复合体”可实现抗P-选择素单抗与脂质微泡外壳的有效连接而成功构建携带抗P-选择素单抗靶向微泡;2.普通微泡与靶组织的粘附主要是通过非特异的方式通过白细胞介导实现的;携带抗P-选择素单抗靶向微泡则主要通过与靶组织血管内皮细胞P-选择素直接特异性结合实现主动性靶向。3.应用携带抗P-选择素单抗靶向微泡行心肌对比超声检查产生的“主动性靶向超声分子成像”可有效评价小鼠心肌缺血再灌注损伤,将可用于评价微血管炎症或相关的血管内皮反应;