论文部分内容阅读
肿瘤的产生由肿瘤的起始、进展、侵袭和转移等过程组合,涉及许多内源性和外源性因素。一般认为癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活是引发肿瘤形成的主要原因。然而,由于不同肿瘤在基因表达上以及其在病理表现上的差异极大地增加了我们对肿瘤发生和发展理解的难度。人类B细胞淋巴瘤是B淋巴细胞发生的恶性肿瘤,主要分成霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类。非霍奇金淋巴瘤种类众多,其中的弥漫性大B细胞淋巴瘤病例在我国所有淋巴瘤患者中占比约50%。弥漫性大B细胞淋巴瘤的分子生物学特征包括肿瘤Myc的过表达以及肿瘤抑制基因p53的突变,为此我们课题组近20年来建立了弥漫性大B细胞淋巴瘤的小鼠模型并进行了深入研究。然而在Myc和p53之外,是否还有其他重要的基因参与弥漫性大B细胞淋巴瘤的发生发展尚不清楚。为此,我们将三种基因敲除小鼠:miR-144/451敲除鼠(miR-144/451-/-),p53敲入鼠(p53 KI),Lnk敲除鼠(Lnk-/-)杂交后得三基因突变小鼠。我们发现5个月龄的三基因突变小鼠全部死于B细胞淋巴瘤/白血病。说明除Myc与p53之外,可能有其他基因参与了 B细胞淋巴瘤的发生与发展。RNA-Seq实验发现,三基因突变的二月龄小鼠脾脏B细胞与其余7组对照组小鼠的脾脏B细胞相比,假基因RPL34-PS1显著高表达。因此我们猜测,假基因RPL34-PS1可能参与了 B细胞淋巴瘤的发生与发展。假基因(pseudogene,PS)是由于序列上少量的差异而丧失正常功能的DNA序列,因而长期被认为是没有功能的生物废料。但是有研究发现核糖体蛋白(ribosomal protein,RP)基因能够产生大量加工的假基因,这些假基因分散在整个基因组中。虽然假基因一度被认为是无活性的,但是现有研究表明它们具有调节其他编码和非编码基因表达水平的能力。同时也有研究表明假基因的异常表达能够作为预测一些癌症发生的标志物。核糖体是蛋白质合成必不可少的细胞机器,是调控生命过程的重要工厂。核糖体的生物发生是一个始于核仁,高度复杂且耗能的过程。虽然在核糖体组装和蛋白翻译中起着重要作用,但是自它们被发现起,其独立于核糖体之外的功能一直受到极大的重视。科学研究已经发现不同癌症中核糖体蛋白基因的突变,例如在子宫内膜癌(RPL22),T细胞急性淋巴细胞性白血病(RPL10,RPL5和RPL11),慢性淋巴细胞性白血病(RPS15),结直肠癌(RPS20)和神经胶质瘤(RPL5)中发现了核糖体蛋白基因的突变。目前已经发现了十几种核糖体蛋白可以激活肿瘤抑制蛋白p53通路来应对核糖体应激。此外,这些核糖体蛋白也广泛参与其他生理和病理过程。但是RP与淋巴瘤尤其是与B细胞淋巴瘤的关系却鲜有报道。本课题为了研究核糖体蛋白RPL34及其假基因RPL34-PS1是否与B细胞淋巴瘤的发生发展有关,我们构建了过表达RPL34-PS1以及RPL34的B淋巴细胞系MSCV-RPL34-PS1-38B9和pBABE-RPL34-38B9后,通过体外的增殖、凋亡等实验,同时在体内荷瘤后,通过测量肿瘤实体大小和重量,组织学分析肿瘤组织,并取肿瘤细胞进行增殖、凋亡等实验研究RPL34-PS1以及RPL34对B细胞淋巴瘤的影响。并且对这种影响的可能机制做初步探讨,为研究和治疗B细胞淋巴瘤提供新的思路和潜在靶点。方法:1.通过 CD19 磁珠抗体分选出 WT,miR-144/451-/-,Lnk-/-,P53 KI,Lnk-/-miR-144/45 1-/-,p53KILnk-/-,miR-144/451-/-Lnk-/-,p53 KImiR-144/451-/-Lnk-/-共 8 组小鼠脾脏中的 B 细胞。2.RNA-Seq分析8组小鼠脾脏B细胞,寻找异常上调和下调的基因。3.将PCR所得的RPL34与RPL34-PS1序列分别克隆到逆转录病毒载体pBABE-Puro和MSCV-PIG上,随后将克隆到的质粒pBABE-RPL34以及MSCV-RPL34-PS1与包装质粒pcl-eco共转染293T细胞,包装产生逆转录病毒。用该病毒液感染鼠B淋巴细胞系38B9,随后使用嘌呤霉素筛选,构建出稳定过表达RPL34和RPL34-PS1的细胞系pBABE-RPL34-38B9和MSCV-RPL34-PS1-38B9后,通过体外的增殖、凋亡等实验,同时在体内荷瘤后,通过测量肿瘤实体大小和质量,组织学分析肿瘤组织,取肿瘤细胞进行增殖、凋亡等实验研究RPL34-PS1以及RPL34对B细胞淋巴瘤的影响。4.通过chromas软件分析RPL34和RPL34-PS1在8组小鼠的脾脏B细胞,38B9,pBABE-RPL34-38B9和MSCV-RPL34-PS1-38B9细胞中的表达情况,寻找两者的比例关系并初步分析可能的机制。结果:1.与其余 7 组小鼠(WT,miR-144/451-/-,Lnk-/-,P53 KI,Lnk-/-miR-144/451-/-,p53 KILnk-/-,miR-144/451-/-Lnk-/-)的脾脏B细胞相比,假基因RPL34-PS1在三基因突变小鼠(p53KImiR-144/45 1-/-Lnk-/-)的脾脏B细胞特异性高表达。2.过表达的假基因RPL34-PS1在体外对38B9的细胞周期,增殖能力以及细胞凋亡并无明显影响,体内荷瘤的实验发现过表达RPL34-PS1能够显著提高38B9的成瘤能力,组织学分析肿瘤组织显示过表达RPL34-PS1能够显著增加肿瘤的恶性程度和增殖能力,分离肿瘤组织细胞流式分析发现凋亡的细胞显著减少。提示相较于体外培养,RPL34-PS1的功能更主要的是改变肿瘤微环境而促进淋巴瘤生长。3.过表达真基因核糖体蛋白RPL34在体外就能够显著增加38B9细胞周期的S期以及增殖能力,同时能够显著减少38B9细胞的凋亡,这一点与RPL34-PS1明显不同。体内的荷瘤实验也显示过表达RPL34能够显著增加38B9的成瘤能力。4.分析发现,除了在三基因突变小鼠中,RPL34-PS1的表达高于RPL34,即使在过表达外源性RPL34-PS1的38B9淋巴瘤细胞中,RPL34-PS1的表达仍然低于内源性RPL34。结论:1.RPL34以及RPL34-PS1均能够促进B细胞淋巴瘤的发生和发展。2.假基因RPL34-PS1可能是通过改变肿瘤微环境促进B细胞淋巴瘤的发生与发展。3.RPL34与RPL34-PS1的比例有可能会影响B细胞淋巴瘤的发生与发展。