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目的：探讨左归丸促进衰老大鼠骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSC)增殖的调控机制。根据“肾精亏虚致衰老理论”和“干细胞具有先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式”理论假说，在前期左归丸对衰老大鼠骨髓MSC增殖效应的基础之上，进一步探讨左归丸促进衰老大鼠骨髓MSC增殖的分子调控机制。为“精”的干细胞学说提供更充分的科学依据，也为中医药干预干细胞移植治疗难治性疾病提供有力的实验依据。 方法：⑴全骨髓贴壁法分离、培养MSC，通过形态学观察和免疫荧光技术检测细胞表面标志物鉴定骨髓MSC。⑵左归丸调控衰老大鼠骨髓MSC增殖的机制：经腹腔注射一定浓度D-半乳糖建立亚急性衰老大鼠模型。治疗选用补肾益精经方左归丸水煎剂灌胃；细胞培养到P3代，RT-PCR检测细胞因子BMP-2、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-7、LIF、OSF、SCF、SDF-1、p21、p16、p53、c-Myc mRNA的表达;Real-time PCR进一步检测差异基因的表达水平。Western blot检测差异基因的蛋白表达水平；基因芯片技术筛选Wnt/β-Catenin信号通路中差异表达的基因，Western blot检测差异基因的蛋白表达水平。⑶左归丸对体外诱导的衰老骨髓MSC增殖效应和机制的初步研究：运用全骨髓贴壁法分离、培养骨髓MSC。细胞培养至P3代，加入D-半乳糖诱导细胞衰老。左归丸组给予含一定浓度左归丸水煎剂的培养液进行干预培养；细胞姬姆萨染色观察细胞的形态;细胞衰老β-半乳糖苷酶染色评价细胞衰老阳性率;MTT法、流式细胞周期术检测比较各组细胞的增殖能力；RT-PCR检测各细胞因子BMP-2、G-CSF、GM-CSF、IL-6、IL-7、LIF、OSF、SCF、SDF-1、p21、p16、p53、c-Myc mRNA表达。Real-time PCR进一步检测差异基因的表达水平。 结果：①免疫荧光染色法检测大鼠MSC表面标志抗原，CD44表达为阳性，CD45表达为阴性。②左归丸调控衰老大鼠骨髓MSC增殖的机制：各组P3代细胞形态:正常组细胞生长良好，细胞呈梭形漩涡状生长，胞核呈规则圆形;模型组细胞生长缓慢，细胞较大，胞核不规则，胞质可见颗粒状物质，并见不同程度的细胞膜破裂;中剂量组细胞生长较好，胞核大部分呈规则分布，胞核可见少量颗粒状物质，未见明显细胞膜破裂；Real-time PCR检测:衰老大鼠骨髓MSC SCFmRNA表达水平显著低于正常组和中剂量组(P＜0.05)，p21mRNA表达显著高于正常组和中剂量组(P＜0.05)；Western blot检测:模型组SCF蛋白表达量显著低于正常组(P＜0.01)、p21蛋白表达量显著高于正常组(P＜0.01);中剂量组SCF蛋白表达量显著高于模型组(P＜0.05)、p21蛋白表达量显著低于模型组(P＜0.05)；在Wnt/β-Catenin信号通路89个相关基因中:与正常组比较，模型组表达上调基因有Kremenl、Kremen2、Wnt4等，表达下调基因有Wnt2、Wnt3a、Wnt7a等。与模型组比较，中剂量组上调基因有Wnt2、Wnt3a、Jun等，表达下调基因有Kremen2、sFRP5、Wnt9b等；Western blot检测Wnt/β-Catenin信号通路差异基因的蛋白表达水平:模型组细胞Wnt3a表达量显著低于正常组(P＜0.01)、Kremen2蛋白表达量显著高于正常组(P＜0.01);左归丸组细胞Wnt3a蛋白表达显著高于模型组(P＜0.05)、Kremen2蛋白表达量显著低于模型组(P＜0.05)。③左归丸对体外衰老骨髓MSC增殖效应和机制：姬姆萨染色:模型组P3代骨髓MSC呈现衰老细胞形态学特征，左归丸干预治疗后，各组大鼠骨髓MSC的细胞形态与正常组相近；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色:模型组骨髓MSC细胞衰老染色阳性率显著高于正常组和左归丸组(P＜0.01)；MTT结果显示:模型组骨髓MSC增殖能力显著低于正常组和左归丸组(P＜0.01)；细胞周期检测:模型组的细胞多数停滞在DNA复制前期（G1期）（P＜0.01）;左归丸干预治疗后，停滞在G1期的细胞数量显著减少（P＜0.01），多数细胞快速进入DNA复制期；Real-time PCR结果:模型组SCFmRNA表达水平显著低于正常组和中剂量组(P＜0.05);模型组p21mRNA表达水平显著高正常组和中剂量组(P＜0.05)。 结论：⑴采用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的大鼠骨髓MSC。⑵左归丸具有显著的延缓干细胞衰老作用，可通过抑制Kremen2和促进Wnt3a途径激活Wnt/β-Catenin信号通路，并促进SCF表达，抑制p21表达，调节细胞周期，从而促进衰老大鼠MSC增殖。⑶左归丸水煎液可促进MSC体外衰老模型的增殖能力，其机制可能与p21和SCF表达有关。⑷从分子和蛋白水平证明了“干细胞具有先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式”理论假说的的科学性，丰富“肾藏精”现代理论新实质。