背景与目的：　　在发展中国家，乳腺癌是死亡率最高的女性恶性肿瘤。手术、化疗和放疗一直是乳腺癌主要治疗方法，但放、化疗严重的毒副作用是临床应用的主要障碍。舟山眼镜蛇细胞毒素1（Cytotoxin1，CTX1）是舟山眼镜蛇毒中分离出的小分子碱性多肽，以往的研究表明，CTX1对多种肿瘤细胞具有选择性杀伤作用，对人乳腺癌细胞MCF-7的杀伤作用尤为明显，并提示CTX1诱导MCF-7细胞死亡的作用与溶酶体膜通透(Lysosome membrane permeabilition，LMP)有关。本实验采用MCF-7细胞进一步研究CTX1诱导LMP以及细胞死亡的机制。主要研究内容有：1）体内体外实验检测CTX1对人乳腺癌细胞株MCF-7细胞和裸鼠移植瘤的抑制作用；2）CTX1对LMP的影响和程度以及与毒性作用的关系；3）各种抑制剂在CTX1诱导MCF-7细胞死亡中的作用；4)促凋亡蛋白Bid在CTX1诱导MCF-7细胞死亡中的作用。研究结果提示，CTX1引起的细胞死亡是溶酶体介导的细胞死亡。　　方法：　　1.CTX1对MCF-7细胞作用的抑制作用　　1.1 MTS法检测CTX1对MCF-7相对活力的影响；　　1.2 流式细胞术检测Annexin V-FITC、PI双染后细胞死亡情况；　　1.3 制备裸鼠MCF-7移植瘤模型，监测瘤重、肿瘤生长曲线和体重等指标，HE染色和透射电镜观察移植瘤形态学变化；　　2.CTX1对MCF-7细胞溶酶体通透性的检测　　2.1 激光共聚焦显微镜下观察LysoTracker Red溶酶体特异性染色；　　2.2 荧光显微下观察溶酶体荧光右旋糖苷释放实验；　　2.3 荧光显微下观察Cathepsin L免疫荧光染色；　　2.4 荧光显微下观察Galectin-3免疫荧光染色；　　2.5 流式细胞术检测溶酶体吖啶橙染色；　　2.6 胞浆及全细胞组织蛋白酶B（Cathepin B）活性检测；　　2.7 Western blotting检测Cathepsin L的表达。　　3.Western blotting检测Bid在CTX1诱导MCF-7细胞死亡中的作用。　　4.流式细胞术检测各抑制剂对CTX1诱导MCF-7细胞死亡的逆转作用。　　结果：　　1.CTX1对MCF-7细胞生长和裸鼠移植瘤的影响　　1.1 CTX1对MCF-7细胞生长的影响：CTX1对MCF-7的细胞活力具有抑制作用，不同浓度的CTX1（0.625、1.25、2.5μg/ml）作用于MCF-7细胞24h，细胞相对活力分别为(93.7±2.0)%、(58.9±4.5)%、(16.7±3.5)%；用CTX11.25μg/ml处理细胞12h、24h和36h，MCF-7细胞相对活力分别为(78.3±6.2)%、(58.9±4.5)%、(31.8±5.0)%，CTX1对MCF-7细胞的抑制作用呈剂量依赖和时间依赖。CTX1诱导MCF-7细胞死亡以晚期凋亡和坏死为主，早期凋亡不明显。用CTX11.25μg/ml处理细胞24h，细胞坏死率为(32.20±2.406)%，晚期凋亡率为(14.467±2.013)%，而早期凋亡率仅为(3.11±1.04)%。　　1.2 CTX1抑制MCF-7裸鼠移植瘤的生长：CTX10.42mg/kg组能够抑制MCF-7移植瘤的生长，瘤重与阴性对照组相比有统计学差异（p＜0.05）；与阳性对照阿霉素组相比，CTX10.42mg/kg组对裸鼠体重影响较小，有统计学差异（p＜0.05）。CTX10.42mg/kg组MCF-7肿瘤坏死面积明显增加，残留肿瘤细胞灶更少，可见大片状坏死；超微病理显示该组肿瘤细胞中溶酶体数量减少，周围线粒体肿胀，嵴断裂消失，可见凋亡细胞。　　2.CTX1对MCF-7细胞溶酶体通透性的影响　　2.1 利用LysoTracker Red、荧光右旋糖苷和Cathepsin L标记溶酶体，CTX1作用MCF-7细胞3h后，显微镜下即可观察到荧光强度明显减弱，荧光右旋糖苷和Cathepsin L标记还可观察到荧光状态的改变，即由对照组颗粒样荧光变为细胞浆内弥漫性着色。CTX1作用MCF-71h起，即可见到Galectin-3在细胞胞浆内少量聚集，随着处理时间的延长，绿色荧光颗粒逐渐增多，体积增大，亮度增加，呈粗颗粒点灶状。　　2.2 流式细胞术检测吖啶橙染色后MCF-7细胞荧光强度变化，结果显示：CTX11.25μg/ml处理细胞6h、12h和24h，FL3通道低荧光强度的细胞所占比率分别(7.79±0.50)%、(14.33±1.00)%、（74.17±2.67)%，而溶剂对照组为(3.08±0.71)%。随着CTX1处理时间的延长，MCF-7低荧光强度细胞所占比率不断增加，荧光强度较对照组明显减弱，差异具有统计学意义（p＜0.05）。　　2.3 胞浆、全细胞Cathepsin B活性检测：加药处理MCF-7细胞12h，CTX10.625μg/ml组细胞胞浆内的Cathepsin B活性增强，而CTX11.25μg/ml全细胞Cathepsin B活性降低，均与阴性对照组比有显著统计学差异（p＜0.05）。胞浆/全细胞CB活性比升高，升高幅度约为对照组的2倍。采用Western blotting检测Cathepsin L的表达，CathepsinL蛋白表达逐渐减少。　　3.Bid蛋白在CTX1诱导MCF-7细胞死亡中的表达：应用CTX11.25μg/ml处MCF-7细胞3h、6h、12h和24h，CTX1处理组的Bid表达明显减弱。　　4.流式细胞术检测各抑制剂对CTX1诱导MCF-7细胞死亡的逆转作用：　　（1）与CTX11.25μg/ml组相比，E64d，α-tocopherol，Z-VAD-FMK，3-MA均能拮抗CTX1对MCF-7的毒性作用，减少MCF-7细胞的死亡，细胞死亡减少，差异具有统计学意义（p＜0.05），其中3-MA和E64d的逆转效率较高；E64d的逆转高峰出现在CTX1作用24h，α-tocopherol的逆转高峰与E64d相比出现较晚，36h才出现较大幅度逆转；　　（2）各抑制剂不能改变CTX1诱导的细胞死亡方式，MCF-7细胞死亡还是以晚期凋亡和坏死为主；　　（3）BaF1对CTX1的毒性没有拮抗作用，与CTX1组死亡率相比，细胞死亡明显增多，具有统计学意义（p＜0.05）。　　结论：　　1.CTX1能够抑制MCF-7细胞和裸鼠移植瘤的生长，并诱导MCF-7细胞发生晚期凋亡和坏死，CTX1的作用具有剂量依赖性和时间依赖性。CTX1对MCF-7移植瘤的抑制效率与阿霉素相似但是全身毒副作用较轻；　　2.CTX1在早期就能引起MCF-7溶酶体膜的损伤，造成LMP，导致胞浆内Cathepsin B活性增高；CTX1所致MCF-7细胞死亡符合溶酶体介导的细胞死亡途径。溶酶体可能是CTX1细胞毒性的靶标细胞器之一；　　3.Bid蛋白和线粒体氧化应激可能参与CTX1诱导的MCF-7细胞死亡过程。