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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的一种接触性传染病,可感染不同年龄、品系的猪,以感染怀孕母猪、仔猪为主,该病主要症状表现为发热、厌食、妊娠母猪早产、晚期流产、产死胎等,给世界养猪产业造成了巨大的经济损失。PRRSV的最大特点是能够引起免疫抑制和继发性感染,目前的PRRSV疫苗对PRRSV防控效果不甚理想,PRRSV一直是严重危害养猪业的重要病源之一。细胞免疫在PRRSV免疫保护中起着重要作用,筛选PRRSV的T细胞表位,研究其免疫调控机制,对研发PRRSV新型疫苗具有重大意义。前期的研究表明,PRRSV结构蛋白(GP)2a对机体的免疫保护具有重要作用。本实验旨在筛选GP2a的T细胞表位和B细胞表位,为进一步研究PRRSV的感染与调控打下基础。本实验通过生物信息学的方法,对GP2a的T、B细胞表位进行预测,并通过重叠多肽法进行鉴定；提取PRRSV BJ-4毒株的总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,以cDNA为模板扩增GP2a基因,并将其连接于pMD19-T载体,构建了重组质粒pMD19-T-ORF2;运用SYFPEITHI、RANKPEP、IEDB生物信息学软件预测CD8+T细胞表位,运用Propped预测与MHC-Ⅱ分子相结合的CD4+T细胞表位,运用DNAstar软件、ABCpred、Bepipred1.0预测GP2a的B细胞表位。结果表明,CD8+T细胞表位区为51～59、56～64、78～86、105～113、143～151、173～181、182～190、198～206、202～210位氨基酸；MHC-Ⅱ结合的表位肽有9个,氨基酸区域分别为75～83、89～97、116～124、144～152、172～180、181～189、183～191、191～199、211～220位氨基酸；B细胞表位区为41～47、51～66、86～93、104～119、122～126、150～165、195～208位氨基酸。以pcDNA3.1-ORF2为模板,使用Primer Premier 5.0设计出一对针对GP2a胞外区的特异性引物进行体外扩增,将目的基因连接到原核表达载体pET-32a (pET-32a-eORF)上,1 mmol/L丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌Rosetta(DE3),经鉴定GP2a胞外区蛋白以包涵体形式表达,分子量约为36 kDa。同时,对包涵体变性与复性,将复性后蛋白以50μg/只的剂量免疫Balb/C小鼠,经三次免疫后效价可达到1：102400,该结果显示GP2a的胞外区具有良好的免疫原性。利用Overlapping方法鉴定出GP2a的B细胞表位为第18号肽(194-208aa),经ELISA确定表位的核心区是195-207aa位的PTPGSRPKLHDFQ。将终浓度为20 μg/mL肽库或单肽体外刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞并使用小鼠IFN-y ELISA试剂盒检测细胞上清中IFN-y的OD450值,判定T细胞表位分别为位于41-58aa的SPSPVGWWSFASDWFAPR和位于185-202aa的STLNQVFAIF PTPGSRPK。