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中华绒螯蟹Eriocheir sinensis(俗称河蟹、大闸蟹)是一种重要的淡水养殖蟹类,可创造巨大的经济价值。然而,随着集约化养殖的快速发展,由细菌、病毒和寄生虫等病原引起的各种病害日益严重,给河蟹养殖业造成了重大的经济损失。和其它无脊椎动物一样,中华绒螯蟹缺乏真正的适应性免疫,只能依赖其先天免疫系统来识别病原,抵御病原侵染。因此,研究其免疫防御机制,尤其是免疫相关基因作用机制对于疾病防御具有重要意义。凝集素是一类可结合糖类物质的蛋白,是甲壳动物中一种重要的模式识别受体,但目前关于L-型凝集素(L-type lectins,LTLs)的功能研究却很少。钙结合蛋白定位于内质网中,在Ca2+存储、糖蛋白折叠和蛋白质合成质量控制中行使功能。最近研究发现,钙连蛋白(Calnexin,Cnx)和钙网蛋白(Calreticulin,Crt)作为凝集素样分子伴侣,在细胞免疫中有一定作用。Toll信号通路具有重要的免疫功能,可调节抗菌肽的表达,在抵御革兰氏阳性菌和真菌入侵时发挥关键作用。MicroRNAs(miRNAs)是在转录后水平上调节基因表达的一种短链非编码RNA,参与包括免疫应答在内的许多生物学过程。有报道表明,病原入侵后可导致miRNA表达量发生变化,进而调控其靶基因的表达,在宿主与病原互作中发挥作用。为了阐明这些免疫相关基因在病原入侵后的具体作用机制,本研究选取两种L-型凝集素(ERGIC-53和VIP36)、两种凝集素样分子伴侣(Cnx和Crt)及Toll信号通路中的异源三聚体(Myd88、Tube和Pelle),深入探讨这些基因在中华绒螯蟹免疫系统中的作用。另外,着重于研究WSSV利用中华绒螯蟹miR-7,抑制宿主的Myd88-ILF2-(IL-16L)抗病毒信号途径,揭示miRNA在介导宿主和病原间相互作用的分子机制。本论文研究结果主要包括以下4个方面:1.中华绒螯蟹L-型凝集素的基因克隆和功能鉴定我们在中华绒螯蟹肝胰腺中克隆得到两种L-型凝集素(EsERGIC-53和Es VIP36)。EsERGIC-53cDNA 全长 1955 bp,包含一个 1506 bp 的开放阅读框,编码501个氨基酸。EsVIP36的cDNA全长为3474 bp,开放阅读框为984 bp,编码一个含327个氨基酸残基的蛋白。预测的EsERGIC-53和EsVIP36蛋白都含有一个信号肽和一个L-型凝集素样结构域。EsERGIC-53和EsVIP36分布广泛,表达于所有检测的河蟹组织中,且脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的刺激会引起其表达量的上调。体外重组表达的EsERGIC-53和EsVIP36 LTLD结构域不能直接凝集细菌,但在Ca2+存在下能够凝集多种革兰氏阳性菌和阴性菌。EsERGIC-53-LTLD和EsVIP36-LTLD在不需要Ca2+参与的情况下不仅可以结合7种细菌,还能直接与病原菌表面的多糖(LPS、PGN、甘露糖D-Mannose和氮乙酸甘露糖胺N-Acetyl-D-mannosamine)结合。此外,当与副溶血弧菌孵育结合后,EsERGIC-53-LTLD和EsVIP36-LTLD可以在河蟹体内促进机体对弧菌的清除作用。这些结果表明EsERGIC-53和EsVIP36作为模式识别受体积极参与了中华绒螯蟹的先天免疫应答。2.中华绒螯蟹钙连蛋白和钙网蛋白的分子克隆和功能研究我们从中华绒螯蟹体内鉴定了两个钙结合蛋白,命名为EsCnx和EsCrt。EsCnx的cDNA全长为3175 bp,开放读码框为1797 bp可编码598个氨基酸。EsCnx蛋白含有一个信号肽、一个钙网蛋白结构域和一个跨膜结构域。EsCrt全长为1741 bp,1221 bp的开放读码框编码406个氨基酸。EsCrt蛋白含有一个信号肽、一个钙网蛋白结构域和一个卷曲螺旋区域。在mRNA和蛋白水平上,EsCnx和EsCrt主要分布于血细胞、肝胰腺、鳃和肠中,细胞免疫荧光结果进一步显示EsCnx和EsCrt主要定位于血细胞内质网膜上。另外,荧光定量PCR和免疫印迹结果表明,EsCnx和EsCrt的表达量在受到脂多糖、肽聚糖、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌刺激后均呈上调趋势。重组蛋白EsCnx和EsCrt不仅可以结合多种革兰氏阳性和阴性菌,选择性紧密结合于微生物表面的多糖(LPS和PGN),还可以在河蟹体内加快机体对副溶血弧菌的清除速率。而利用RNA干扰沉默EsCnx或EsCrt的表达量会削弱河蟹对副溶血弧菌的清除效率。这些结果表明EsCnx和EsCrt作为模式识别受体,在中华绒螯蟹先天免疫中起到重要的防御作用。3.中华绒螯蟹Toll信号通路关键因子(Myd88、Pelle)的基因克隆和功能研究在本研究中,我们首次克隆得到了中华绒螯蟹髓样分化因子88(My88)和Pelle基因(命名为EsMyd88和EsPelle)。EsMyd88全长2210 bp,包括一个1416 bp的开放阅读框可编码472个氨基酸。预测的EsMyd88蛋白包含一个死亡结构域和一个白介素 1 受体(Toll-Interleukin 1 receptor,TIR)结构域。EsPelle 全长序列为3797 bp,含有3156 bp的开放阅读框,编码一个1051个氨基酸的多肽。预测的EsPelle蛋白含有一个死亡结构域和一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。在健康河蟹的组织中,EsMyd88在血细胞和神经中的表达量最高,而EsPelle在鳃、肝胰腺和血细胞中表达相对较高。在脂多糖、肽聚糖、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或嗜水气单胞菌感染的河蟹肝胰腺和血细胞中,EsMyd88和EsPelle的表达量显著上调。Pull-down实验表明重组蛋白EsMyd88和EsTube之间存在直接的相互作用。在果蝇S2细胞中过表达EsMyd88、EsTube和EsPelle,能够激活果蝇抗菌肽的启动子。在河蟹体内,RNA干扰沉默EsMyd88和EsPelle的表达后能够抑制多种河蟹抗菌肽(抗脂多糖因子Anti-lipopolysaccharide factor,ALF、甲壳素Crustin和溶菌酶lysozyme)的表达。综上,我们的研究结果说明Toll信号通路关键因子EsMyd88、EsTube和EsPelle在河蟹体内是真实存在的,并且发挥了类似于果蝇中的抗细菌防御作用。4.中华绒螯蟹miR-7调控Myd88在WSSV感染中的分子机制在本论文中,我们选择分布广泛、受到白斑病毒(white spot syndrome virus,WSSV)感染后表达量明显上调的miR-7来探讨miRNA在宿主与病毒互作中的调控作用。我们发现,体外合成miR-7模拟物miR-7-mimic过表达miR-7后,能够增加病毒拷贝数,反之当miR-7被反义核酸AMO-miR-7敲低后,病毒拷贝数明显降低,说明miR-7在病毒侵染过程中起促进作用。通过三种生物信息学软件预测和单荧光报告质粒靶基因验证系统的研究分析,miR-7可以直接靶向抑制宿主Myd88基因的表达。通过RNA干扰方法抑制Myd88的mRNA水平后,病毒拷贝数明显增加。当敲低Toll信号通路三个关键因子Myd88、Tube和Pelle的表达水平后,白介素增强子结合因子2(interleukin enhancer binding factor,ILF2)和白细胞介素-16(Interleukin-16,IL-16L)的表达量随之显著下调,表明ILF2和IL-16L是依赖于Myd88的Toll信号通路的下游基因。过表达miR-7,更是可以抑制ILF2和IL-16L的表达。更有趣的是,ILF2作为转录调控因子,可以调控IL-16L的表达,并且IL-1dL在河蟹抗WSSV的过程中起着积极的应答作用。我们的研究表明WSSV利用中华绒螯蟹miR-7,抑制宿主的Myd88-ILF2-(IL-16L)抗病毒信号途径,从而进行免疫逃逸,促进病毒的复制。