论文部分内容阅读
在哺乳动物早期胚胎空间发育研究中,由于空间环境的特殊性和飞行器搭载限制,必须采用密闭培养(包括液密和气密)体系进行胚胎培养。密闭培养就是在培养前预先向胚胎培养液中充入气体比例明确的标准气,使标准气溶于培养液中,以提供胚胎发育的气相支持;然后快速地将充气培养液和早期胚胎装入密闭培养容器,并将培养容器密封后进行胚胎培养。本研究所在实验室已经初步确定适宜小鼠早期胚胎密闭培养的基础培养液、胚胎培养密度、培养液充气标准气气体比例以及充气时间,并依据发育相关生长因子及其受体在早期胚胎中的表达情况确定了适宜的生长因子添加方案。本研究在前期研究的基础上,通过对小鼠早期胚胎密闭培养体系适宜培养温度范围和血清浓度的筛选,进一步优化可支持早期胚胎体外正常发育的密闭培养体系;并应用实时荧光定量PCR技术检测优化密闭培养体系中胚胎主要转录因子的相对表达水平,以探讨优化的密闭培养体系是否能够支持小鼠早期胚胎正常发育。研究工作内容与研究结果为:1.使用气体比例为5%O2,5%CO2,90%N2的标准气对胚胎培养液充气130 min,向充气培养液中添加0.1 ng/mL EGF和1 ng/mL IGF-1后,立即在不同温度(36,36.5,37,37.5,38℃)下进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。通过分析密闭培养72 h和96 h后的胚胎发育率、胚胎细胞计数和密闭培养96 h后的胚胎细胞凋亡检测结果,筛选适宜小鼠早期胚胎密闭培养的温度范围。结果显示,当培养温度为36.5℃和37℃时,胚胎发育率和胚胎细胞总数较高,均显著高于其他各组,且密闭培养96 h后胚胎细胞凋亡率显著低于其他各组(P<0.05);当培养温度为36℃时,胚胎发育率降低,胚胎发育阻滞现象明显;当培养温度为37.5℃和38℃时,胚胎卵裂球缩小、碎裂,培养96 h后胚胎细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05)。结果说明,培养温度在36.5~37℃之间可较好地支持密闭培养体系中小鼠2细胞胚胎发育至囊胚和孵化胚阶段。依据本试验结果,在卫星硬件设计时我们选择使用36.8±0.2℃的温度控制系统。2.使用气体比例为5%O2,5%CO2,90%N2的标准气对不同胚胎培养液(含体积分数分别为2.5%,5%,7.5%,10%,15%,20%的胎牛血清)充气130 min,向充气培养液中添加0.1 ng/mL EGF和1 ng/mL IGF-1后立即进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。通过对密闭培养72 h和96 h后的胚胎发育率、胚胎细胞计数和密闭培养96 h后的胚胎细胞凋亡检测结果进行分析,筛选适宜小鼠早期胚胎密闭培养的血清浓度。结果显示,当培养液血清浓度为7.5%和10%时,密闭培养72 h后囊胚形成率、密闭培养96 h后囊胚孵化率以及胚胎细胞总数较高,胚胎细胞凋亡率较低,二者之间差异不显著(P>0.05),且二者均与其他各组差异显著(P<0.05);当培养液血清浓度为5%和15%时,胚胎发育率和胚胎细胞总数显著低于7.5%血清浓度组,且胚胎细胞凋亡率显著高于7.5%血清浓度组(P<0.05);当培养液血清浓度为2.5%时,部分胚胎发生退化,培养96 h后胚胎细胞凋亡率显著高于其他各组(P<0.05);当培养液血清浓度为20%时,密闭培养72 h后囊胚形成率显著低于其他各组(P<0.05),胚胎呈现明显的发育延缓现象。结果说明,向胚胎培养液中添加7.5%~10%的胎牛血清时,可较好地支持密闭培养体系中小鼠2细胞胚胎发育至囊胚和孵化胚阶段。在后续试验中,选择向胚胎培养液中添加7.5%的胎牛血清进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。3.在上述研究结果的基础上,使用气体比例为5%O2,5%CO2,90%N2的标准气对含体积分数为7.5%胎牛血清的胚胎培养液充气130 min,向充气培养液中添加0.1 ng/mL EGF和1 ng/mL IGF-1后立即在37℃下进行小鼠2细胞胚胎的密闭培养。应用实时荧光定量PCR技术对转录因子Oct4,Nanog,Sox2和Cdx2在密闭培养72 h后的小鼠囊胚中的表达情况进行检测,并与常规微滴培养72 h后的小鼠囊胚和体内同步发育胚胎相比较。结果显示,体外培养72 h后的密闭培养组胚胎中Oct4,Nanog,Sox2和Cdx2 mRNA相对表达水平都与体内同步发育胚胎差异不显著(P>0.05);微滴培养组胚胎中Oct4和Sox2 mRNA相对表达水平均略低于体内同步发育胚胎,但差异不显著(P>0.05);微滴培养组胚胎中Nanog和Cdx2 mRNA的相对表达水平均显著低于体内同步发育胚胎(P<0.05)。上述结果说明,优化后的密闭培养体系中小鼠胚胎具有较好的发育潜能,该体系能够支持小鼠早期胚胎在密闭培养条件下正常发育。