论文部分内容阅读
MicroRNA (miRNA)是近年来发现的一类长度约为20-25个核苷酸的具有转录后调节功能的非编码单链的小分子RNA,在病毒、植物、动物等多种有机体中广泛存在。研究发现,miRNA具有调节细胞的增殖、分化和凋亡的作用,是一种新型的调控因子。在人类基因组中,miRNA多聚集在一些与肿瘤相关的基因多变区及脆性位点,多种肿瘤的发生发展与miRNA的异常表达密切相关。miR-199a/b-3p是高度保守的miRNA,在肝癌、卵巢癌、肾癌等多种肿瘤中表达异常,可参与肿瘤的发生发展,调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭力的改变,检测其表达水平可用于肿瘤临床诊断、病理分型及其预后的判定。本研究旨在研究miR-199a/b-3p在乳腺癌细胞中的表达情况,研究miR-199a/b-3p表达对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移侵袭的调控作用,并验证分析niR-199a/b-3p在乳腺癌中的潜在靶基因和相关的信号通路,以期为miR-199a/b-3p在乳腺癌诊断、治疗、预后分析及其早期防治领域的实践和应用提供实验依据。目的：研究miR-199a/b-3p对乳腺癌细胞的增殖、凋亡和迁移侵袭作用的影响和机制。方法：(1)脂质体法转染入乳腺癌细胞；(2)niR-199a/b-3p mimics法检RT-PCR测细胞内和靶基因的表达；(3)miRNA方法检测靶基因及相关信号Western blot通路蛋白的表达变化；(4)MTT法检测细胞增殖能力变化；(5)流式细胞术检测细胞周期；(6)细胞划痕和小室迁移与侵袭实验；(7)荧光素酶报告基Transwell因检测验证与靶基因3’UTR的结合；(8)以miR-199a/b-3p统计软件进SPSS 17.0行处理数据,实验组间统计分析采用配对T检验。结果：(1)高侵袭力乳腺癌细胞株中miR-199a/b-3p的表达水平降低：相对于低侵袭力的乳腺癌细胞株MCF-7,miR-199a/b-3p在高侵袭力的乳腺癌细胞株MDA-MB-231, SUM149PT, CAL-120, HCC1395中表达水平显著降低。(2) miR-199a/b-3p具有抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用：乳腺癌细胞株MDA-MB-231转染miR-199a/b-3p mimics后,miR-199a/b-3p表达上调,细胞增殖能力,迁移和侵袭能力均受到抑制。上调miR-199a/b-3p的表达水平,可显著抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的增殖能力,抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231的细胞周期进程,可使原癌基因Cyclin D1表达降低,抑癌基因p21和p27表达升高。(3)PAK4是rniR-199a/b-3p的直接靶基因：miR-199a/b-3p通过与靶基因PAK4的mRNA 3’-UTR互补序列结合,pmir-PAK4 3’-UTR组荧光素酶活性miR-199a/b-3p mimics参入组较NC组明显降低(*P<0.05)；随着miR-199a/b-3p表达上调,PAK4的mRNA表达和蛋白质表达均受到抑制,且PAK4通路的p-MEK和p-ERK蛋白表达均下调。(4)PAK4基因表达沉默可以抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭：在MDA-MB-231细胞转染]PAK4 siRNA 48h后,PAK4蛋白表达下降,p-MEK和p-ERK蛋白表达均下调,MDA-MB-231细胞增殖水平在48h和72h后明显降低(**P<0.01),细胞周期受到抑制,G1期阻滞延长,可使原癌基因Cyclin D1表达降低,抑癌基因p21和p27表达升高,细胞的迁移和侵袭数量明显减少。同时,转染PAK4基因的真核基因表达载体pcDNA3.1-PAK4入低侵袭力的乳腺癌细胞株MCF-7中,PAK4蛋白表达上调,p-MEK和p-ERK蛋白表达均提升,MCF-7细胞增殖能力明显增强(*P<0.05)(5)PAK4过表达可以恢复miR-199a/b-3p对乳腺癌细胞的抑制功能。PAK4真核基因表达载体pcDNA3.1-PAK4与miR-199a/b-3p mimics共转入MDA-MB-231细胞中,miR-199a/b-3p对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭抑制作用在加入PAK4真核基因表达载体pcDNA3.1-PAK4后得以部分恢复,差异有统计学意义(*P<0.05或**P<0.01)。结论：(1) miR-199a/b-3p在高迁移侵袭性乳腺癌细胞株中表达明显下调；(2)在乳腺癌细胞中恢复miR-199a/b-3p的表达可以抑制细胞周期进程,抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力；(3)PAK4的mRNA 3’-UTR与miR-199a/b-3p互补序列结合,是其直接靶基因；(4)在乳腺癌细胞中,抑制PAK4的表达可以抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力；(5)在转入miR-199a/b-3p的乳腺癌细胞中同时上调PAK4的表达,可以使miR-199a/b-3p对乳腺癌细胞的抑制作用得以部分恢复；(6) miR-199a/b-3p可通过调控靶基因PAK4及其信号通路而发挥对乳腺癌细胞的抑制作用。