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脑卒中是指由脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一种疾病。卒中分为两种,缺血性脑卒中和出血性脑卒中,通常90%的病人为缺血性脑卒中,主要发生在大脑中动脉。目前,静脉注射溶栓类药物和血栓切除术是治疗缺血性脑卒中一线治疗方法,但溶栓类药物的治疗时间窗为4.5 h。鉴于能够使用溶栓类药物或血栓切除术的患者较少,因此,寻找及时有效的防治脑卒中的治疗策略是临床医学迫切需要解决的关键问题。而针对缺血后炎症反应作为缺血性脑卒中新的治疗手段已经在基础研究中和临床研究中受到高度重视,这种治疗手段可能对患有永久性局部缺血但有良好侧枝循环供血的脑卒中患者也有较佳的疗效。炎症反应是缺血性脑卒中发病过程中的重要环节,应答脑中风的第一个免疫细胞为驻留脑部的小胶质细胞,在缺血性脑卒中急性期,小胶质细胞被激活,然后这些循环的免疫细胞侵入梗死周围区和梗死核心区,通过可溶性和膜结合信号分子(包括细胞因子)参与脑卒中后的炎症反应,炎症在脑卒中后的特定阶段可能是一把双刃剑,一方面它可以促进梗死的扩大,另一方面是梗塞消退的原因,并影响重塑和修复。脑缺血发生后,活化的小胶质细胞分为M1型和M2型,M1型小胶质细胞分泌一系列的促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、COX-2和NO加重脑损伤,而抑制小胶质细胞过度活化导致的炎症反应可改善脑缺血引起的继发性脑损伤。脑心通胶囊作为临床上治疗脑卒中的常用药物之一,能够减轻脑梗死患者神经功能损伤和抑制炎症反应等作用。药理学研究表明,脑心通胶囊能够改善脑梗死体积、降低脑水肿和脑组织炎性细胞因子的分泌。但目前的研究还主要集中于脑心通胶囊治疗缺血后炎症的药效学研究,脑心通胶囊是否能够通过抑制炎症反应减轻脑缺血损伤及其分子机制如何并不十分清楚。因此,本课题采用LPS诱导的小胶质细胞BV-2炎症模型,观察脑心通胶囊肠吸收液对炎性细胞因子分泌的影响,首先从体外模型证明其对炎性反应的影响;进一步从转录因子角度,采用高通量测序技术,对脑心通胶囊肠吸收液抑制脑缺血炎症反应进行交联分析,筛选脑心通胶囊肠吸收液抑制脑缺血慢性炎症差异表达的mRNA和lncRNA,并通过基因间的相互作用关系分析,构建调控网络,以期从转录组学层面,探讨脑心通胶囊抑制脑缺血炎症反应的分子机制,为脑心通胶囊防治缺血性脑卒中提供新的作用靶点。研究内容1.观察不同浓度的脑心通胶囊肠吸收液对BV-2细胞活力的影响,建立LPS诱导的小胶质细胞BV-2炎症模型,采用ELISA法和Griess法测定TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、COX-2和NO的分泌,并测定脑心通胶囊肠吸收液干预后上述细胞因子的分泌。2.采用RNA-Seq测定脑心通胶囊肠吸收液预处理后小胶质细胞BV-2中差异表达的lncNRA和mRNA,结合生物信息学方法对差异表达的lncRNA和mRNA进行GO和KEGG分析,筛选与炎症相关的差异表达基因,构建lncRNA-mRNA调控网络,分析lncRNA靶向调控的网络中可能参与脑心通胶囊抑制炎症的lncRNA和mRNA。3.建立大鼠MCAO模型,观察脑心通胶囊对MCAO大脑海马组织炎症因子分泌,并通过qRT-PCR对上一部分筛选的基因在大鼠整体MCAO模型和体外LPS诱导小胶质细胞BV-2炎症模型,进行进一步验证。研究结果1.脑心通胶囊肠吸收液对LPS诱导小胶质细胞BV-2炎症因子分泌的影响31.25μg·mL-1和62.5 μg·mL-1脑心通胶囊肠吸收液对BV-2有显著的增殖作用,以62.5 μg·mL-1为最佳浓度。在1.0μg·mL-1 LPS诱导的BV-2炎症模型中,LPS 能够显著促进 BV-2TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、COX-2 和 NO 的释放,而不同浓度的脑心通胶囊肠吸收液(7.81 μg·mL-1、15.63 μg·mL-1、31.25 μg·mL-1、62.5μg·mL-1)能够显著抑制上述细胞因子的释放。2.基于RNA-Seq的脑心通胶囊肠吸收液对1.0 μg·mL-1 LPS诱导的BV-2炎症差异表达lncRNA和mRNA研究(1)脑心通胶囊肠吸收液干预1.0μg·mL-1 LPS诱导小胶质细胞BV-2炎症中差异表达的lncRNA和mRNA研究结果表明,1.0μg·mL-1 LPS刺激后,差异表达的lncRNA和mRNA分别为87个和519个,而给予脑心通胶囊肠吸收液干预后,34个lncRNA和392个mRNA被逆转。GO功能富集分析显示这些被逆转的基因主要通过影响炎症反应、细胞对白细胞介素-1的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、免疫反应和趋化因子介导的信号通路等参与脑心通胶囊肠吸收液干预LPS诱导的炎症反应。在这些显著被逆转的lncRNA和mRNA中,lncRNA Gas5和Meg3以及mRNA Ccl2、Cc15、Cc17、Cxcl1、Cxcl10、Cx3cl1、Tnfaip3、Tnfrsf9、1118、Il1b、116、Rarres2、Tlr3、Tlr7可能参与脑心通胶囊肠吸收液干预LPS诱导的小胶质细胞BV-2炎症反应。(2)脑心通胶囊肠吸收液干预LPS诱导小胶质细胞BV-2炎症中差异表达的lncRNA-mRNA共表达分析根据Pearson相关系数,筛选了 34差异表达的lncRNA和1664个差异表达的mRNA靶向调控关系,形成4405个lncRNA-mRNA调控基因对。其中LncRNA Gas5靶向调控的62个差异表达的mRNA可能通过影响炎症反应、趋化因子信号通路、细胞对肿瘤坏死因子的反应和免疫过程参与脑心通胶囊肠吸收液干预LPS诱导的BV-2炎症反应。3.LncRNA Gas5及其共表达的mRNA在脑缺血大鼠海马和BV-2中的表达以及脑心通胶囊肠吸收液的干预作用110 mg·kg-1脑心通胶囊肠吸收液能够改善大鼠MCAO模型海马组织TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、COX-2和NO)的分泌,qRT-PCR测定结果显示,脑心通胶囊肠吸收液能够抑制MCAO模型大鼠海马组织和LPS诱导的小胶质细胞BV-2 中 lncRNA Gas5 和 mRNA Cc15、IL-1b、IL-6 的表达,促进 Tnfaip3 的表达。小结本研究证明,体内及体外实验显示,脑心通胶囊能够改善脑缺血后炎症反应;高通量测序和qRT-PCR筛选结果及体外实验和整体实验验证显示,脑心通胶囊肠吸收液通过干预lncRNA Gas5及其靶向调控的Cc15、IL-1b、IL-6和Tnfaip3参与脑缺血后的炎症反应,为脑心通胶囊从抑制炎症角度防治缺血性脑卒中提供了科学依据。创新点1.本文将RNA-Seq高通量测序技术手段引用到脑心通胶囊干预缺血性脑卒中炎症发生机制的研究中,揭示了脑心通胶囊逆转的差异表达lncRNA和mRNA通过影响炎症反应、对白细胞介素-1的反应、对肿瘤坏死因子的反应和趋化因子信号通路等参与缺血性脑卒中后续的发生发展过程。2.基于高通量测序及lncRNA-mRNA共表达网络分析,揭示了 lncRNAGas5靶向调控的62个mRNA可能参与了脑心通胶囊干预缺血后炎症反应。3.高通量测序手段联合整体和体外实验验证,发现脑心通胶囊可能通过lncRNA Gas5及其靶向调控的mRNA Cc15、Il-lb、I1-6和Tnfaip3参与脑缺血后炎症反应,可能成为脑心通胶囊防治缺血性脑卒中新的作用靶点。