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研究目的: 缺血性心脏病是危及人类健康的主要疾病。丹参素和川芎嗪分别来自于两大传统中药丹参和川芎,是公认的具有确切心血管活性的有效成分。临床使用上,二者具有协同作用。本实验室前期将两分子丹参素与一分子川芎嗪偶合,得到新化合物D2T。本课题旨在观察D2T在叔丁基过氧化氢诱导的氧化损伤模型上的心肌保护作用,并进一步探索其可能的作用机制。 研究方法: 本研究通过150μM叔丁基过氧化氢(t-BHP)刺激建立H9c2心肌细胞急性氧化应激损伤模型。首先,D2T或对照药丹参多酚酸盐(MLB)预保护2h,随后加入t-BHP,诱导特定时间后进行各项处理及如下相关指标检测:(1)MTT法检测细胞活力;(2)LDH释放率;(3)DCFH-DA、DHE、DHR123荧光探针分别检测细胞内总ROS、超氧阴离子(O2-)、过氧亚硝基(ONOO-)水平;(4)试剂盒检测细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平;(5)Hoechst33342/PI双染检测细胞凋亡与坏死比率;(6)JC-1法检测线粒体膜电位;线粒体肿胀度、细胞内ATP含量检测;(7)Western Blot法检测细胞线粒体凋亡通路相关蛋白(Bcl-2,Bax,Cyt c,Caspase-3和Cleaved-caspase-3)表达情况;PI3K/Akt及Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达情况。此外,建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,测定大鼠心肌梗死面积,评价D2T对大鼠心肌梗死的保护作用。 研究结果: 1、D2T能够显著增强细胞活力,对抗t-BHP所诱导的H9c2心肌细胞氧化损伤,其保护作用具有浓度依赖性,并且D2T的作用明显优于相同浓度的对照药MLB及丹参素与川芎嗪混合物(2DSS+TMP)处理组。同时,D2T也能显著地降低细胞内LDH释放率。 2、D2T能够显著地降低t-BHP作用后细胞内活性自由基(包括ROS,O2-,ONOO-)的水平,以及脂质过氧化物MDA的含量。 3、D2T抑制线粒体膜电位下降,减轻线粒体肿胀程度,恢复细胞内ATP的含量。 4、Hoechst33342/PI双染结果显示,D2T能够显著地减少细胞的凋亡和坏死。Western Blot结果提示D2T能够提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,降低促凋亡蛋白Bax,Cyt c及Cleaved-caspase-3的表达。 5、D2T能够显著提高H9c2心肌细胞内p-PI3K、p-Akt蛋白的表达,该作用可被特异性PI3K抑制剂wortmannin完全阻断。D2T也能显著提高细胞内Nrf2和HO-1蛋白的表达水平。 6、D2T能够显著降低心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死面积。 研究结论: 新型丹参素衍生物D2T能够显著的保护t-BHP诱导的H9c2心肌细胞急性氧化损伤,减少细胞的凋亡和坏死、降低细胞内自由基的水平,减轻线粒体损伤。其保护作用可能通过激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1信号通路实现的。此外,D2T能显著降低心肌缺血再灌注大鼠的心肌梗死面积。因此,本研究为D2T成为抗心肌缺血/再灌注候选药物提供了初步理论依据。