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猪链球菌（Streptococcus suis，S. suis）是一种重要的人兽共患病病原菌。在猪链球菌的多个血清型中以2型猪链球菌（Streptococcus suis serotype2，S. suis 2）分布最广、检出率最高、致病力最强。人感染猪链球菌后可患败血症，肺炎，关节炎和脑膜炎等疾病，甚至会造成死亡，目前有关猪链球菌的具体致病机制尚未完全阐明。细菌蛋白酪氨酸磷酸化由酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶共同参与调控，目前已经在多个病原菌中发现酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶参与调控病原菌的致病过程，在细菌中发现的酪氨酸磷酸酶主要分为两种：低分子量酪氨酸磷酸酶（low molecular weight protein tyrosine phosphatases，LMWPTP）和聚合酶组氨酸磷酸酶家族（polymerase and histidinol family of phosphoesterases，PHP）。但是在S. suis中尚未见酪氨酸磷酸化系统相关报道，鉴定S. suis可能存在的酪氨酸激酶和磷酸酶，有助于进一步探索酪氨酸磷酸化系统在S. suis中的作用，并为S. suis的防治提供新的思路。根据本课题组前期完成的S. suis2中国强毒株05ZYH33全基因组注释分析发现，SSU05_0565为荚膜多糖（capsular polysaccharide biosynthesis，cps）合成基因簇成员，为Cps2B编码基因，SSU05_0566编码酪氨酸激酶 Cps2C，SSU05_0567 编码酪氨酸磷酸酶 Cps2D，编码 Cps2B、Cps2C、Cps2D蛋白的基因均位于荚膜操纵子上，SSU05_1691编码低分子量酪氨酸磷酸酶，本文将其命名为SS-PTP。本文以S. suis2中国强毒株05ZYH33为研究对象，以Cps2B、Cps2C、Cps2D、SS-PTP为研究靶标展开相关研究，具体实验方案及研究结果如下： 1. 酪氨酸激酶和磷酸酶的生物信息学分析及蛋白的制备 利用NCBI数据库及ClustalX软件对Cps2B、Cps2C、Cps2D、SS-PTP编码基因进行生物信息学分析，结果表明Cps2B属于Wzz家族， Cps2B是一种二次跨膜蛋白。Cps2C属于细菌酪氨酸激酶，具有典型的WalkerA、WalkerA＇、Walke rB基序。Cps2D是PHP型酪氨酸磷酸酶，SS-PTP属于低分子量酪氨酸磷酸酶，具有保守结构域CX5R。同源序列比对及跨膜区分析提示Cps2B蛋白C末端结构域可能是 Cps2C 酪氨酸激酶的激活剂，利用大肠杆菌表达系统成功表达纯化了Cps2B、Cps2C、Cps2D、SS-PTP、Cps2BctC，通过定点突变技术成功获得突变蛋白SS-PTPC33A、SS-PTPR39A。同时将制备的重组SS-PTP蛋白免疫新西兰兔成功制备了抗SS-PTP兔多克隆抗体，对进一步确认SS-PTP蛋白的细胞定位奠定了基础。 2. 酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶的酶学研究 以对硝基苯酚钠盐为底物进行酶活测定。分别对重组蛋白 Cps2C 和Cps2BctC进行酶活检测，结果表明：Cps2C无酪氨酸激酶活性，Cps2BctC具有酪氨酸激酶活性。且Cps2BctC最适酶促反应条件为pH6.5，温度37℃。体外磷酸化检测 Cps2BctC 能够发生酪氨酸自磷酸化，磷酸化质谱检测 Cps2BctC 蛋白存在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化，进一步Western Blot验证发现Cps2BctC确实存在丝苏氨酸磷酸化。Cps2D、SS-PTP蛋白酪氨酸磷酸酶活性检测结果显示，仅SS-PTP有活性，且其最适酶促反应条件与Cps2BctC蛋白相同，突变型SS-PTPC33A、SS-PTPR39A酶活检测明显低于野生型SS-PTP蛋白，SS-PTP蛋白体外酪氨酸残基去磷酸化检测发现，SS-PTP蛋白对Cps2BctC蛋白无去磷酸化作用。 3.SS-PTP基因功能研究 成功构建了PUC18-SS-PTP敲除质粒，利用基因同源重组技术将敲除质粒电转S. suis2感受态，经组合PCR筛选和RT-PCR验证敲除株ΔSS-PTP构建正确。抗SS-PTP兔多克隆抗体检测野生株和敲除株SS-PTP蛋白表达情况，敲除株ΔSS-PTP不表达SS-PTP蛋白，野生株表达SS-PTP蛋白且存在于胞质中。野生株和敲除株在细菌表型、溶血活性、体外细胞实验、小鼠毒力实验等方面均无明显差异。但是在细菌生长速率方面ΔSS-PTP敲除株生长速率减慢。 综上所述，本研究在生物信息学分析的基础上，成功制备了Cps2B、Cps2C、Cps2BctC、Cps2D、SS-PTP蛋白，以及SS-PTP的定点突变蛋白SS-PTPC33A、SS-PTPR39A，并对这些重组蛋白进行了酶学研究，发现Cps2B蛋白C末端23个氨基能够使处于失活状态的Cps2C产生酪氨酸激酶活性，激活后的Cps2C不仅发生酪氨酸自磷酸化，同样存在丝苏氨酸自磷酸化。酶活测定发现Cys33和Arg39是SS-PTP潜在的活性位点。成功构建了敲除株ΔSS-PTP，与野生株相比，SS-PTP基因敲除之后在细菌表型及毒力方面并无明显差异，提示SS-PTP编码基因不参与调控细菌分裂，也并非毒力决定性因子，但是在生长速率方面，敲除株 ΔSS-PTP 生长速率低于野生株，提示SS-PTP可能参与调控S.suis2生长代谢。以上研究对于后续进一步确立S.suis 2酪氨酸激酶与酪氨酸磷酸酶的作用底物以及探究与其他信号转导系统之间的作用关系奠定基础。